[发明专利]人工改造合成的杀虫基因及其编码的蛋白质与应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种人工改造合成的杀虫基因以及其构建的植物表达载体及其在抗虫转基因植物研制方面的应用。

背景技术

植物生长过程中易遭受虫害，每年因虫害造成的农作物损失量十分巨大。为防治植物虫害发生，需大量喷施农药，长期大量使用化学农药，可导致害虫抗药性增强，并且会大量杀伤其天敌，生态失衡，步入恶性循环。利用基因工程手段使植物获得抗虫性，目前已被广泛采用，用于植物抗虫基因工程的基因主要包括：(1)苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)基因：如Cry1Ac，Cry1F，Cry2Ab等；(2)蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitors，PIS)基因：如豇豆(Vigna sinensis)胰蛋白酶抑制剂(cowpea trysin inhibitor，CpTI)基因CpTI等；(3)淀粉酶抑制剂(amylase inhibitor，AI)基因：如菜豆(Phaseolusvulgaris)α-淀粉酶抑制剂基因α-αi等；(4)植物外源凝集素(lectin)类基因：如雪花莲外源凝集素(Galanthus nivalis aggulutinin，GNA)基因gna等；(5)昆虫特异性神经毒素(neurotoxin)基因：如蝎毒素基因Bank I T₄等。在生产上利用最成功的基因主要有：Bt杀虫晶体蛋白基因和CpTI基因。其中应用最广泛的是Bt杀虫晶体蛋白基因，即苏云金芽孢杆菌(Bt)内毒素晶体蛋白基因，克隆于苏云金芽孢杆菌。苏云金芽孢杆菌(Bt)是1901年发现的一种革兰氏阳性土壤芽孢杆菌，已知其是可产生对多种昆虫，如鳞翅目(Lepidopterans)、鞘翅目(Coleopterans)和双翅目(Dipterans)等作物害虫有毒性的多种伴孢结晶蛋白质。这种杀虫蛋白质已经发现了五十多大类，三百多种。Bt杀虫蛋白在昆虫消化道内消化酶的作用下，蛋白被水解，释放出约60～70kDa抗蛋白酶的活性毒素分子。活性毒素分子可与肠道上皮细胞纹缘膜上的特异性受体结合，并发生作用而使细胞膜穿孔。消化道上皮细胞的离子、渗透压平衡遭到破坏，最终导致昆虫死亡。由于其杀虫的专一性和高度选择性，所以对植物和包括人在内的动物没有毒害，而且是环境可以接受的。自80年代后期以来，许多实验室已将Bt杀虫基因导入到不同植物组织的细胞中，并已在被转化的细胞和植物中表达了这种来源与微生物的杀虫基因，使转基因植物具有抗虫性。

不同种类Bt杀虫蛋白杀虫谱可能不同，目前人们已经发现了对鳞翅目、鞘翅目、双翅目据有毒性的杀晶体蛋白的大小及性状也不同。在1995年无脊椎病理学会(Society for Invertebrate Pathology，SIP)年会上专门成立了由Crickmore等人组成的Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会，提出了以杀虫蛋白氨基酸序列同源性为唯一标准的分类命名体系，将杀虫基因分为17类，36亚类(Crickmore et al.1995)，2008年增补为54类，101亚类(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。其中Cry2Aα对棉铃虫、红铃虫、玉米螟、烟芽夜蛾、粉纹夜蛾、黎豆夜蛾、稻纵卷叶螟、大豆夜蛾、热带家蚊等害虫均具有杀虫效果。

由于遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分，如果直接将昆虫的基因直接转化至植物中，在一定程度上会影响其蛋白的表达，利用偏爱密码子(preferred codons)并避免利用率低的或稀有的密码子合成基因，可以增加蛋白表达量。

另外Bt杀虫晶体蛋白的N端小段氨基酸残基在毒蛋白活化过程中被切除是杀虫活性所必须的。

发明内容

为提高转基因植物的抗虫性，本发明的目的在于提供一种在植物中能高效表达的杀虫基因。

一种人工改造合成的杀虫基因，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

一种人工改造合成的杀虫基因，具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相比，5’端在起始密码子后少84个碱基。

所述核苷酸序列采用了植物偏爱性密码子。

所述核苷酸序列采用了棉花偏爱性密码子。

本发明的第二个目的在于提供一种含有上述人工改造合成的杀虫基因并可在植物中表达该杀虫基因编码的杀虫蛋白质。