[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物疫苗技术领域，尤其属于对猪繁殖与呼吸综合征进行免疫保护的二价重组腺病毒疫苗及其制备方法。

技术背景

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的，以妊娠母猪流产、死胎、弱仔等繁殖障碍及仔猪的呼吸道征状和高死亡率为特征的传染病。

自1987年在北美首次报道以来，至今几乎扩散到全球所有养猪业发达的国家和地区，给养猪业及其产品贸易造成了巨大的经济损失，已成为养猪业的主要病毒性疾病之一。我国于1995年底爆发该病，随后迅速蔓延到全国大部分省份。近年来PRRS疫情又有加重趋势，且混合感染和持续性感染状况严重。目前用于预防PRRS的疫苗主要是传统疫苗—弱毒苗和灭活疫苗。尽管弱毒苗能提供较好的免疫保护，但存在毒力返强和散毒的危险；而灭活苗诱导产生的抗体水平很低，且极不稳定。因此，研制更安全、更有效的疫苗来预防和控制该病的发生与流行已迫在眉睫。

PRRSV是一种单股正链的RNA病毒，属于套式病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科(Arterividae)动脉炎病毒属(Artervirus)，同属的还有马动脉炎病毒(EAV)、小鼠乳酸脱氢酶增高征病毒(LDV)和猴出血热病毒(SHFV)。其基因组大小约15kb，具有9个开放阅读框架(0RFs)，且彼此相互嵌套。ORF1(包括ORF1a和ORF1b)编码病毒的复制酶，其大小约占全基因组的3/4；ORFs2～4分别编码病毒的GP2a、GP2b、GP3和GP44种次要结构蛋白，ORFs 5～7编码3种主要结构蛋白GP5、M和N。GP5为囊膜糖蛋白，是一种多功能蛋白，参与细胞免疫与体液免疫，尤其是中和抗体的产生，是基因工程疫苗设计的主要靶抗原；M蛋白是非糖基化膜蛋白，具有较强的免疫原性，可诱导产生一定的中和抗体和特异性细胞免疫应答，在介导病毒的吸附和诱导细胞免疫中具有重要作用；而GP5与M蛋白可通过二硫键形成GP5/M异源二聚体，对病毒装配起重要作用，并介导病毒吸附宿主细胞过程。

目前，大多数研究者为了发挥GP5的病毒中和优势作用和M蛋白的细胞免疫作用及两者所形成的二聚体对病毒进入靶组织和细胞的作用，通过不同的表达系统共表达和融合表达此二者，即在同一表达系统中使用双启动子(Yunbo Jianget al.，2006，Vaccine，24，2869-2879；Qisheng Zheng et al.，2007，Virus Genes，35，585-595)；或在GP5和M蛋白基因之间引入内部核糖体进入位点(IRES)(李俊等，2006，动物医学进展，27(10):78-81)；或通过一柔性多肽Linker序列(Wenming Jiang et al.，2006，Veterinary Immunology and Immunopathology，113，169-180)将GP5和M蛋白基因连接一起的表达策略。但这些策略存在一些缺陷，比如被表达的基因起始效率低、上游基因与下游基因的表达严重不平衡、启动子之间相互干扰、被表达蛋白性质与其天然蛋白的性质不尽相同等问题。

发明内容

本发明目的是，针对以往为利用GP5和M蛋白基因功能，所采用的双启动子、或引入内部核糖体、或通过一柔性多肽序列等将两者相连接表达策略所存在的被表达基因起始效率低、上游基因与下游基因表达严重不平衡、启动子之间相互干扰、或被表达蛋白性质与其天然蛋白性质不尽相同等缺陷，研制一种能克服上述缺陷的，并使受体猪能产生针对PRRSV特异性的中和抗体和较强的细胞免疫力，以达到有效控制、治疗猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的新型二价重组腺病毒基因工程疫苗；本发明的另一目的是提出该疫苗的制备方法。

本发明目的通过以下技术方案得以实现：

猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗，该疫苗可通过在PRRSV GP5和M蛋白之间插入一具有自我裂解的FMDV2A基因相连接，构建成GP5-2A-M融合蛋白基因，并与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组，将重组病毒DNA经酶切，转染HEK-293A细胞后，得重组腺病毒rAd-GP5-2A-M，经腺病毒纯化、扩增等工艺、步骤，制备成二价重组腺病毒疫苗而获得。

猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗的制备方法，该方法按以下步骤进行：