[发明专利]一种超临界CO2溶剂中的微生物诱变方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种微生物诱变方法，尤其是一种超临界CO₂溶剂中的微生物诱变方法。

(二)背景技术

微生物诱变是一项十分常用的工业生物技术，现行的诱变方法主要分化学法与物理法两类。化学法就是以化学诱变剂，如硝基胍、硫酸二乙酯等在水中对微生物进行诱变，提高微生物的性能，特别是提高所需目的产物的表达量。物理法诱变是以物理的手段，如紫外线照射、γ射线照射等方法对微生物进行诱变，从诱变后的微生物中筛选性能提高的菌株。目前，对微生物诱变较有效的化学诱变剂，对人体均有致癌、致畸作用，安全性非常差，使用后对环境生产严重危害。物理诱变的方法中，诱变效果较好的方法，对人体也有致癌、致畸作用，诱变过程对环境有严重影响，而对人体和环境较安全的方法，则对微生物诱变的效果较差。

因而，急需发明一种诱变效果较理想、而对人体和环境安全性高的微生物诱变方法。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种具较理想的诱变效果而对人体无致癌致畸致突变作用，对环境无影响，有良好安全性的微生物诱变方法。

本发明采用的技术方案为：

一种超临界CO₂溶剂中的微生物诱变方法，所述微生物诱变在超临界CO₂溶剂中进行。本发明要点在于以超临界CO₂为溶剂进行诱变，所述临界CO₂溶剂中，除了加入菌液外，还可添加各种化合物(如二甲亚砜或肼、双氧水或丙酮等)以促进诱变，也可不额外添加任何物质，直接将菌液置于临界CO₂溶剂中进行诱变。

具体的，所述方法可包括：将微生物菌种接种至适合所述微生物菌种的液体培养基，培养至对数生长期，得到细胞数约为1.0×10⁸个的菌液；将菌液移入高压釜中，压入CO₂至釜内压强为8～12MPa，控制温度为30～45℃，恒温恒压保持20～60分钟后，缓慢释放CO₂，至釜内压力降至0.3MPa时，将菌液压入无菌容器中，进行筛选，选出成活菌株即为诱变的微生物菌株。

或者，所述方法包括：将微生物菌种接种至适合所述微生物菌种的液体培养基，培养至对数生长期，得到细胞数约为1.0×10⁸个的菌液；将菌液移入高压釜中，按5～30g/L菌液的添加量加入有机物二甲亚砜或肼或丙酮或30％体积分数的双氧水，压入CO₂至釜内压强为8～12MPa，控制温度为30～45℃，恒温恒压保持20～60分钟后，缓慢释放CO₂，至釜内压力降至0.3MPa时，将菌液压入无菌容器中，进行筛选，选出成活菌株即为诱变的微生物菌株。

本发明以超临界CO₂为溶剂，在超临界CO₂中以有机化合物与微生物接触，对微生物产生诱变。所选的有机物均对人体无致癌致畸致突变作用，因而安全性非常高。而在超临界CO₂介质中，CO₂可将有机物带入微生物细胞中，有机化合物与微生物细胞中的遗传物质作用，起到诱变微生物的效果。

优选的，所述微生物菌种为黄杆菌属(Flavobacterium)的水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)，所述液体培养基按如下终浓度组成配制：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，NaOH调pH为7.5，溶剂为水。

或者，所述微生物菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，所述液体培养基按如下终浓度组成配制：牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，葡萄糖1％，NaOH调pH为7.2，溶剂为水。

上述培养基组成以质量体积百分比表示，某物质浓度1％表示100mL培养基中含有1g该物质。

具体的，所述方法如下：

(1)液体培养基配制：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，NaOH调pH为7.5，溶剂为水，灭菌，接入黄杆菌，30℃、200r/min条件下培养至培养液中细胞浓度为1.0×10⁸个/mL，得菌液；