[发明专利]一种肾结石大鼠模型构建方法及实验方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种肾结石大鼠模型构建方法，以及利用该肾结石大鼠模型进行肾结石大鼠肾脏组织THP表达研究的实验方法。

(二)背景技术

肾结石是泌尿外科常见病、多发病，发病率高，且随着生活水平的提高，其发病率呈上升趋势。因此肾结石的发生机制和防治研究一直是泌尿外科医师关注的问题。近年来国际上的研究发现Tamm-Horsfall蛋白(Tamm-Horsfall protein，THP)可能是一种抑制尿路结石形成的大分子有机物。但是THP抑制结石形成的机制及其所起的作用，不同的研究结果不同，仍存在争议。虽然国外有研究者报道了肾结石大鼠肾脏组织THP表达的研究结果，但还没有治疗因素干预下肾结石大鼠肾脏组织THP表达的研究报道。

枸橼酸是研究最早最充分的结石抑制因子之一，但其确切的防石机制，与其他大分子抑制因子之间的关系还有待于进一步研究。因此，研究枸橼酸钾干预下肾结石大鼠肾组织内THP的表达，了解枸橼酸钾干预对肾组织THP表达的影响，进一步探讨枸橼酸钾抑制结石形成的机制，及枸橼酸钾与THP之间的相互关系，这不仅为解析肾结石发病机理提供实验依据，对临床寻求肾结石的防治途径也具有一定的指导意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种肾结石大鼠模型构建方法，以及利用该肾结石大鼠模型进行肾结石大鼠肾脏组织THP表达研究的实验方法。

本发明采用的技术方案是：

一种肾结石大鼠模型构建方法，所述方法包括：以含乙二醇0.5％和氯化铵0.5％的混合溶液为致石剂，用致石剂替代饮用水喂养SD大鼠至少2周，获得肾结石大鼠模型。

一种肾结石大鼠肾脏组织THP表达研究的实验方法，所述方法包括：选用雄性SD大鼠，饲养一周后，以含乙二醇0.5％和氯化铵0.5％的混合溶液为致石剂替代饮用水喂养SD大鼠2周，处死大鼠，解剖取肾脏，进行大鼠肾脏组织THP表达研究。

具体的，所述方法分对照组、肾结石组、肾结石枸橼酸干预组进行，选用雄性SD大鼠，饲养一周后，分组喂养2周进行造模：对照组以饮用水喂养，肾结石组以致石剂替代饮用水喂养，肾结石枸橼酸干预组以致石剂替代饮用水喂养、并用25％枸橼酸钾溶液以1mL/100g体重每天灌胃一次，2周后处死大鼠，解剖取肾脏，观察肾脏表面形态，再剖开肾脏，取肾组织用10％甲醛固定，于显微镜下观察。

为使3组大鼠实验条件保持一致，在造模过程中，对照组和肾结石组除以饮用水或致石剂喂养外，同时用饮用水以1mL/100g体重每天灌胃一次。

尿液中存在的与肾结石形成有关的物质，大致可以分为两类，一类是促进结石形成的物质，包括草酸、尿酸、钙离子等成分；另一类是抑制结石形成的物质，如枸橼酸、镁离子及一些有机大分子物如骨桥蛋白等，这两类物质比例失衡被认为是引起肾结石形成的主要原因。

乙二醇是草酸的前体，进人体内后转化成羟乙酸，后者经过一系列的酶促反应最终转化为草酸，经肾脏排泄，使得尿草酸浓度升高，从而促进结石形成。氯化铵可以减低尿pH值，有利于草酸钙结晶结石形成。

枸橼酸是尿液中作用最强的内源性结石抑制物之一，流行病学研究证实肾结石患者低枸橼酸尿发生率达到61％，而低枸橼酸尿是肾结石发病和复发的独立危险因素，研究表明枸橼酸可络合钙离子形成可溶性钙复合物，可直接抑制尿液中晶体的成核、生长和聚集，还可通过提高尿液pH值，纠正尿液过度酸化，降低成石离子的饱和度，而抑制肾结石形成。因此临床上用枸橼酸钾治疗肾小管酸中毒、低枸橼酸性草酸钙结石及尿酸性结石。关于枸橼酸钾防治肾结石的机制，一般认为当口服枸橼酸钾后，胃肠道吸收的枸橼酸增加，血枸橼酸浓度上升，从而经肾小球滤过的枸橼酸增加，同时抑制肾小管重吸收，最终尿液中的枸橼酸浓度相应增加，从而抑制结石形成。

THP是尿液中含量最多的蛋白之一，属于糖基磷脂酰肌醇锚定家族成员，由糖基磷脂酰肌醇锚定在肾小管亨氏攀升支粗段及远曲小管近端的尿路上皮细胞膜上，通过磷酸脂酶C分解释放入小管液，其膜固定型分子量约120kD，自由(尿)型单体分子量约85kDa，结构上，THP的70％由肽链组成，30％是糖基。有报道认为THP能阻止大肠杆菌1型黏附于尿路上皮分化特异糖蛋白(Uroplakins)的Ia和Ib受体，可能起阻滞上尿路的感染的作用。通过免疫化学方法在草酸钙结晶体外形成试验的草酸钙有机质中，及乙二醇诱导的大鼠肾模型试验草酸钙结晶中均发现有THP的存在，而在乙二醇诱导的草酸钙尿路结石大鼠模型的肾组织及尿液中THP表达量均减少，因此THP被认为是尿路中结石形成的重要抑制因子。