[发明专利]制备谷胱甘肽响应的壳层二硫键交联非病毒基因载体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及非病毒基因载体的制备方法，尤其是制备谷胱甘肽响应的壳层二硫键交联非病毒基因载体的方法。

背景技术

现代基因技术和人类基因组工程图谱的完成，为采用基因分子生物学方法治疗各类疾病，提高人类生命质量提供了广阔的前景。基因治疗成为当前最活跃的生物高技术领域之一。由于裸露的核酸分子难以在体液中稳定存在，在主要器官中只能实现低层次的表达，寻求能够实现广泛基因表达的基因载体成为基因治疗在大规模临床应用中的关键问题。病毒载体虽然具有较高的转染效率，但潜在的毒性、免疫原性及靶向性等问题限制了其在临床治疗中的应用。开发具有高效安全和组织特异性的非病毒基因载体具有非常重要的意义。

聚乙烯亚胺(PEI)具有优异的浓缩DNA分子的能力，具有的“质子海绵”效应有利于基因载体从溶酶体中逃离出来，是目前常用的一类非病毒基因载体。但PEI/DNA组装体在生理盐溶液中不稳定，易发生聚集，在体内易被网状内噬系统清除，降低基因载体在体内的循环时间并影响基因转染效率。制备壳层交联的基因载体可有效提高在生理盐溶液中的稳定性，但当基因载体被细胞内吞后，交联的壳层必须有效断裂，释放DNA分子并有效转染。由于细胞内外还原型谷胱甘肽含量的巨大差异，因此，寻求制备谷胱甘肽响应的壳层二硫键交联非病毒基因载体很有必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备谷胱甘肽响应的壳层二硫键交联非病毒基因载体的方法。

本发明的制备谷胱甘肽响应的壳层二硫键交联非病毒基因载体的方法，其步骤如下：

(1)合成巯基化聚乙烯亚胺；

(2)配制浓度为0.1～1mg/mL的巯基化聚乙烯亚胺水溶液；

(3)配制浓度为50～250μg/mL的质粒DNA溶液；

(4)将步骤(2)溶液加入到等体积的步骤(3)溶液中，漩涡混合后，静置，得到巯基化基因载体溶液并在空气中搅拌，获得谷胱甘肽响应的壳层二硫键交联非病毒基因载体。

上述的合成巯基化聚乙烯亚胺的方法如下：

在氮气保护下，将巯基乙酸水溶液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺按摩尔比1∶3-6∶3-6混合，在0℃条件下充分反应后，加入支化聚乙烯亚胺的水溶液，支化聚乙烯亚胺与巯基乙酸的摩尔比为1∶10-25，于室温下充分反应后，透析一周，并冻干，得到巯基化聚乙烯亚胺。

上述的质粒DNA为pEGFP。

本发明的有益效果：

1)本发明利用空气中巯基化聚乙烯亚胺的氧化交联，制备壳层二硫键交联非病毒基因载体，方法简单。

2)本发明通过调节巯基化聚乙烯亚胺的巯基化程度、巯基化聚乙烯亚胺与DNA的加入比例，可获得不同转染效率的非病毒基因载体。

3)仿生交联的二硫键壳层有利于提高基因载体在生理盐溶液中的稳定性，而在细胞内高浓度还原型谷胱甘肽的作用下，导致壳层二硫键的断裂，释放DNA分子并有效转染细胞。

具体实施方式

实施例1：

(1)在氮气保护下，将3mmol巯基乙酸溶于15mL三蒸水中，加入15mmol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和15mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在0℃条件下反应6h。称取0.12mmol支化聚乙烯亚胺(PEI_25k)，溶于10mL三蒸水中，加入上述混合的反应液中，于室温下反应过夜。在氮气保护下，将上述溶液透析一周，并冻干，得到粘性的白色固体。对比聚乙烯亚胺的氢核磁谱图，巯基化聚乙烯亚胺已成功制备获得。

将上述制得的巯基化聚乙烯亚胺，采用Ellman法测定巯基的含量。利用半胱氨酸做标准曲线，由于1分子的半胱氨酸与1分子的5，5′-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸(DTNB)发生反应，引起1分子的硝基苯甲酸的释放，在412nm波长处有强烈的吸收。比色法测定结果表明：每一个支化聚乙烯亚胺主链上接枝的自由巯基约为6～7个。

(2)配置NaCl浓度为20mM、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPEs)浓度为20mM、pH为7.4的缓冲溶液。采用该缓冲溶液，配置浓度为0.3mg/mL的巯基化聚乙烯亚胺水溶液。

(3)选用绿色荧光蛋白报告基因pEGFP(4733bp)为目的基因，用步骤(2)的缓冲溶液，配置浓度为200μg/mL的DNA溶液。

(4)取250μl步骤(2)的巯基化聚乙烯亚胺水溶液加入到等体积步骤(3)的DNA溶液中，漩涡混合并静置30分钟后，将得到的巯基化基因载体溶液在空气中搅拌10h，获得壳层二硫键交联的非病毒基因载体。