[发明专利]一种用农杆菌生产瓜类转基因植物的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物转基因领域，具体的讲，就是在用农杆菌侵染瓜类作物的外植体的时候如何防止在以后培养过程中农杆菌菌株污染这些外植体的方法。

背景技术

用农杆菌菌株在一定条件下侵染受伤植物组织，通过改造的农杆菌菌株能把自身的T-DNA或其它外源基因插入到目标植物组织中的基因组中，从而产生新的再生植株，这项技术在植物基因工程中被大量运用。但是，用农杆菌菌株和植物组织共培养后，必然要经过一段时间的培养而分化出愈伤组织及转基因小苗，在浸染后的抗性芽筛选培养过程中，农杆菌污染是影响植物基因转化成功率的一个重要方面。农杆菌污染不仅影响植物组织的生长，甚至导致抗性转基因苗的死亡，同时不断的继代培养也增加工作量，加剧了真菌污染的机会。本发明提供一种新的方法，可以有效防止或减少在以后农杆菌菌株和植物组织共培养中造成对植物组织的污染而使转基因获得成功。

发明内容

为了解决现有的技术问题，本发明提供一种新的方法，可以减少农杆菌在共培养或侵染培养后的污染，从而大大提高转化效率和成功率。

本发明提供的方法包括让农杆菌在10-30℃下与瓜类植物外植体侵染培养5-30分钟后再进行共培养和分化培养。

在一个优选的实施方式中，农杆菌与瓜类的子叶侵染培养的温度为10-20℃，时间为10-15分钟。在此温度下的让农杆菌侵染瓜类植物的子叶可以大大降低对外植体的污染，提高转化效率，增加成活率。较优的，侵染培养的温度为10-15℃。

在一个优选的实施方式中，植物组织为西瓜子叶，或部分子叶组织，这些子叶最好是先经过一段时间的预培养，然后再把带有伤口的子叶与农杆菌一起进行侵染培养。较优选的，农杆菌的浓度为OD＝0.5-0.8，较优的，农杆菌的浓度为OD＝0.5。

在一个优选的实施方式中，侵染培养的时间为10-15分钟，农杆菌为悬浮状溶液，与西瓜子叶或部分子叶处于运动状态中，在进行侵染培养后，除去子叶表面附着的农杆菌菌液。除去的方法可以使用滤纸吸干表面的液体。

农杆菌是产生转基因植物有效的载体工具之一，通过增加或减少一些基因片断构建不同功能的质粒，并把质粒转化到农杆菌中去。一般本领域内技术人员都可以根据不同的要求来构建含有特殊基因片段的农杆菌菌株。许多构建成功的质粒已经商品化或在学术交流中无偿通用。关于如何把质粒转化到农杆菌中去以及如何构建质粒不是本发明的重点，该技术为本领域一般技术人员公知的技术。外植体是指由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官，可以是子叶，根，花等等。

有益效果：本发明所提供的方法可以有效减少农杆菌对瓜类植物外植体在侵染后培养过程中的污染，从而减少外外植体在后续培养或转化过程的死亡，增加获得转基因植物的机会，降低生产成本，提高转化效率。

附图说明

图1，本发明实验所用农杆菌菌株EHA105所含双元载体PBI121质粒的结构。

具体实施方式

实验

为了进一步说明本发明的效果和实施方式，现以实验加以说明。这些具体的实施例子仅仅是在不违背本发明精神下的有限列举，并不排除本领域的一般技术人员把现有技术和本发明结合而产生的其他具体的实施方案。

实验一：用农杆菌侵染西瓜子叶(10℃)

一，材料

培养基配方：按照下表配置MS基本固体培养基(表一)。

MS基本液体培养基。与固体培养基相比，液体培养基不含有琼脂。YEB基本培养基的准备。

分别称取牛肉浸膏(Beef extract)5g，酵母提取物(Yeast extract)1g，多聚蛋白胨(Polypeptone)5g，蔗糖5g，琼脂5g，加水定容至1000mL，调pH至7.2，灭菌后待用。使用时再加1M MgSO₄·7H₂O 2mL/L。西瓜品种：早佳

农杆菌菌株：EHA105

如图1所示为本实验所使用的农杆菌菌株EHA105，它含有双元载体PBI121质粒，包含植物抗性选择标记新霉素磷酸转移酶基因Npt II，和报告基因β-葡糖苷(gusA)。

二，方法

1)西瓜种子消毒并培养无菌苗