[发明专利]含毛囊人工皮肤的制备方法及由其制备的人工皮肤

权利要求书

1.含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)毛囊上皮细胞制备：分离人头皮毛囊，加入分离酶，消化，再将毛囊移入缓冲盐溶液中，飘洗去除分离酶，从毛囊中挤出毛干，用0.125-0.25％胰蛋白酶加EDTA消化成单个毛囊上皮细胞，离心去除胰蛋白酶，用角质形成细胞培养基培养备用；

(2)毛乳头细胞培养：将去除毛干的人毛囊用0.1-0.5％的胶原酶VI消化，待包绕毛囊的真皮鞘消化成单细胞而其内的毛乳头尚未开始消化时，中止消化，液洗，低速离心去除胶原酶VI，吸沉淀过200-400目的筛网，倒冲筛网，用角质形成细胞培养基培养，进行毛乳头细胞培养备用；

(3)含毛囊人工皮肤：将传代培养的毛乳头细胞与毛囊上皮细胞按5∶1至1∶5比例的进行细胞混合，分别注射到皮肤支架上，移植细胞的浓度分别为2.5×10⁴至1×10⁶/ml，然后将皮肤支架置入多孔培养板中，每孔加入角质形成细胞培养基培养，浸没培养1～3周后再行气液界面培养，培养5～10周。

2.根据权利要求1所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征在于：角质形成细胞培养基选用无血清角质形成细胞培养基。

3.根据权利要求2所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征在于：步骤(1)中的无血清角质形成细胞培养基含表皮生长因子EGF 5～15ng/mL、氢化考的松0.2～6μg/mL、胰岛素2～8μg/mL。

4.根据权利要求1所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征在于：步骤(1)缓冲盐溶液选用D-Hanks或PBS。

5.根据权利要求1所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征在于：步骤(1)分离酶的浓度为0.2-0.8％。

6.根据权利要求1所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征在于：步骤(2)中的角质形成细胞培养基含碱性成纤维细胞生长因子bFGF 0.5～5ng/mL。

7.根据权利要求1所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征在于：步骤(3)中的角质形成细胞培养基含表皮生长因子EGF 5～15ng/mL、氢化考的松0.2～0.6μg/mL、胰岛素2～8μg/mL和碱性成纤维细胞生长因子bFGF0.5～5ng/mL。

8.根据权利要求1所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征在于：步骤(3)中传代培养的毛乳头细胞＜6代。

9.根据权利要求1所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征在于：步骤(3)中皮肤支架选用胶原/壳聚糖多孔支架或鼠尾胶原。

10.含毛囊人工皮肤，其特征在于：通过权利要求1～9任意一项权利要求所述的制备方法制备得到。