[发明专利]针对PCDH10C端蛋白片段分子的特异性抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种针对PCDH10C端蛋白片段分子的特异性抗体的制备方法。

背景技术

PCDH10是属于Ca²⁺依赖性钙粘蛋白超家族的一员，具有6个重复串联的胞外区和1个独特的胞内区。我们在对原代肿瘤干细胞基因表达谱时用病毒文库技术筛选时发现pcdh10^-/-细胞易游出和穿过“Transwell”的半透膜，而pcdh10^+/+的细胞迁移性较弱。通过生物信息学分析，进一步克隆了pcdh10的全长cDNA序列并构建了表达pcdh10的真核细胞表达载体，通过脂质体瞬时转染K562细胞、SW480大肠癌细胞发现异位表达PCDH10抑制了这些细胞在体外的增殖，并增加了细胞的凋亡。进一步发现对这些细胞进行无血清饥饿和添加化疗药物等处理后PCDH10表达水平随时间和浓度的增加而增加，提示PCDH10参与了细胞凋亡，可能是一个肿瘤抑制基因。然对其参与细胞凋亡的分子机制尚不明了。为探讨PCDH10在大肠癌组织中的表达改变，我们用1种针对PCDH10胞外区的单抗和多抗时发现PCDH10在大肠癌组织中并无明显的改变。而用针对C末端的引物进行PCR扩增时发现在大肠癌干细胞样细胞中出现了显著的转录下调，表明PCDH10在大肠癌细胞中出现了剪拼改变，PCDH10C端蛋白分子片段可能链接了1个独特的细胞信息转导通路，但目前尚未发现有针对PCDH10C端蛋白分子片段的特异性抗体。

发明内容

本发明的目的是提供一种研究PCDH10C端蛋白质功能的特异性抗体。

针对PCDH10C端蛋白片段分子的特异性抗体的制备方法包括如下步骤：

1)采用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细胞株中将PCDH10C 3’端碱基序列克隆至原核细胞，构建PCDH10C端融合蛋白的原核细胞PCDH10C/pET15b表达载体；

2)将PCDH10C/pET15b表达载体转化BL21DE3pLysS大肠杆菌，建立PCDH10C端融合蛋白的原核细胞表达系统，用His金属螯和树脂纯化PCDH10C端融合蛋白，用Thrombin酶切除PCDH10C端融合蛋白N端的His-tag标签，得到PCDH10C端融合蛋白；

3)用已切除标签的PCDH10C端融合蛋白作为抗原免疫大白兔，产生抗PCDH10C端抗体，收集抗血清，用硫酸铵沉淀、透析、Protein A-Sepharose亲和柱纯化兔抗PCDH10C端抗体。

所述的采用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细胞株中将PCDH10C 3’端碱基序列克隆至原核细胞，构建PCDH10C端融合蛋白的原核细胞表达载体的方法是：将表达PCDH10的1×10⁵～×10⁷人白血病K562细胞离心沉淀，加入0.5～1.5mlTrizol充分混匀，提取总RNA，再用逆转录酶逆转录RNA至cDNA；然后设计上游引物包含Nde I内切酶位点CATATG和下游引物包含BamH I内切酶位点GGATCC，通过PCR的方法直接将PCDH10C端DNA序列克隆至pET15b Nde I/BamH I位点，经Nde I和BamH I内切酶酶切鉴定合格后，进一步用DNA测序验证，合格即为PCDH10C/pET15b表达载体。

所述的将PCDH10C/pET15b表达载体转化BL21DE3pLysS大肠杆菌，建立PCDH10C端融合蛋白的原核细胞表达系统，用His金属螯和树脂纯化PCDH10C端融合蛋白，用Thrombin酶切除PCDH10C端融合蛋白N端的His-tag标签包括如下步骤：

1)取1～3μl鉴定合格的ΔPCDH10/pET15b重组质粒加至10～90μl感受态的BL21DE3pLysS大肠杆菌，冰浴15～45min，38～46℃60s，加入50～350μlLB液30～44℃30～90min，涂布含50～150μg/mL的LB平板，30～44℃培养过夜，次日，挑取菌落接种50～200mlLB液，37℃摇动培养过夜，接种2000～4000ml LB液，30～44℃扩大培养2～8h，加入终浓度为1～7mM的IPTG诱导0.5～6h，离心收集细菌沉淀。