[发明专利]改良Cry3的方法、改良Cry3、质粒及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种增强苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质Cry3对玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera)的杀虫能力的方法，以及利用这种方法获得的改良Cry3、所用质粒，及其在制备转基因抗虫玉米中的应用。 

(二)背景技术

玉米根虫是一种最具有破坏性的玉米害虫。在美国，3种重要种分别为：西方玉米根虫(D.virgifera virgifera)、北方玉米根虫(D.undecimpunctatahowardi)和南方玉米根虫(D.undecimpunctata howardi)。西方玉米根虫和北方玉米根虫是美国玉米栽培中的首要害虫。玉米根虫通过取食植物根部引起植物严重损伤。这种损伤表现在增加玉米倒伏，减少玉米产量和生物量而改变植物的营养含量。玉米根虫的取食还间接影响植物病原生物的侵入，幼虫对根的损伤，使植物病原细菌、真菌等微生物可以更容易侵入到植物中。玉米根虫成虫在夏末玉米田中非常活跃，它们取食叶耳，叶丝和花粉，干扰了玉米的正常授粉。 

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)最早于1902年在日本国发现，1911年在德国再次被发现并得鉴定，是一种格兰氏阳性细菌。在它的孢子形成过程中，合成出大量的杀虫结晶包涵体(insecticidal crystallineinclusions)，其中的晶体蛋白质(crystalline protein，Cry)是由叫做σ-内毒素(σ-endotoxins)的原毒素亚基(protoxin subunit)组成的。大多数的苏云金芽孢杆菌菌株都会产生一系列的σ-内毒素，它对许多昆虫都具有特异的毒性，故这种蛋白质又叫做杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)， 或苏云会芽孢杆菌毒蛋白(Bt toxin)。此外，苏云金芽孢杆菌在生长及芽孢形成期间，还能分泌一些外毒素，叫做苏云金毒素或β-外毒素(β-exotoxin)，同样也具有抑制幼虫生长的能力 

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)δ-内毒素Cry3有杀甲虫的活性。Cry3A蛋白对科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)有很好的杀虫活性，但对Diabrotica属的甲虫没有杀虫活性(Johnson et al.，1993，J.Econ.Entomol.86：330 333)。根据Slaney等所述(1992，InsectBiochem.Molec.Biol.22：918)，Cry3A蛋白对科罗拉多马铃薯甲虫的杀虫活性是南方玉米根虫(D.undecimpunctata howardi)的2000倍。而且，Cry3A蛋白对西方玉米根虫有很小的或者没有杀虫活性。同样，Cry3B对西方玉米根虫有比较低的杀虫能力，但是杀虫活性仍然不够理想。 

由于δ-内毒素杀虫机理的了解，改造δ-内毒素使其更有杀虫活性成为了可能。Li等人1991年确定Cry3A的三维结构时，改造δ-内毒素更成就为一种可能。Cry3A蛋白具有3个结构域：N-端的1-290个氨基酸是第一个结构域，由7个α螺旋组成；第二个结构域从291-500个氨基酸，包含3个β折叠；C-端的501-644个氨基酸是第三个结构域，是一个β-折叠。基于这种结构，提出了一个关于δ-内毒素结构和功能关系的一个假说。这个假说一般来说是结构域I是在昆虫肠膜形成穿孔的主要因素(Gazit and Shai，1993，Appl.Environ.Microbiol.57：2816 2820)，结构域II是和肠膜受体结合的主要部分(Gazit and Shai，1993，Appl.Environ.Microbiol.57：2816 2820)，而结构域III有调节离子通道活性的功能(Chen et al.，1993，PNAS 90：90419045)，最有可能和蛋白的稳定性有关(Li et al.1991，supra)。