[发明专利]甘蔗宿根矮化病菌的快速检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及植物保护领域，尤其是一种甘蔗宿根矮化病菌的快速检测方法。

背景技术：

甘蔗宿根矮化病RSD是普遍存在于所有种植甘蔗地区的一种世界性的重要病害。自1944～1945年在澳大利亚昆士兰首次发现以来，已有美国、南非、毛里求斯、印度、巴西等47个国家和地区报道了该病的发生，遍布世界各蔗区。我国台湾省于1945年最先报道此病的发生，在大陆1986确诊存在甘蔗宿根矮化病，之后广东、福建、广西、云南曾对全省蔗区进行普查，结果表明均存在此病。此病由一种棒杆菌属细菌寄生于蔗株的维管束中引起，主要通过带病蔗种和收获、砍种刀具等传播蔓延，且传播性极强。蔗株染病后变矮，蔗茎变细，生长迟滞，宿根发株少，在干旱地区和种植感病品种的蔗区所造成的损失尤其重要，病害造成损失的程度随宿根年数的增加而增加，一般减产10～30％，干旱缺水时可达60％以上，还可导致品种退化。RSD无明显的外部和内部症状，病原菌难以分离和培养，传统诊断方法极其困难，因而迫切需要建立一种简便、快速、准确、实用的检测方法，以期为该病害的诊断和防治、脱毒种苗的生产、对外甘蔗品种/材料交换检疫检测提供技术支撑。

目前，对甘蔗宿根矮化病菌的检测方法主要有剖茎检测法、相差显微镜检测法和PCR法。但剖茎检测法和相差显微镜检测法准确性差、操作繁琐、检测灵敏度低，PCR法检测体系不易稳定，因此不适合田间大批量样品的快速检测。

发明内容：

本发明的目的是提出一种甘蔗宿根矮化病菌的快速检测方法，该方法克服了现有检测方法的不足，简便、准确、操作简单、适合田间大批量样品检测。

本发明包括以下步骤：1、用打气泵吹气法吹提样品蔗汁；2、离心法制备样液；3、I-ELISA法检测甘蔗宿根矮化病菌RSD。具体步骤如下：

1、样品蔗汁提取：

每个待测甘蔗样本取5～6条蔗茎，每条蔗茎截取中下部茎节，用砍刀切成12～16cm长，每取一个样品后均用70％的酒精消毒砍刀，再用打气泵吹2～3ml的甘蔗汁于2ml离心管内，置于冰上，带回室内放于-18℃冰箱保存备用；

2、样液制备：

取待测蔗汁1000ul于1.5ml离心管旋涡混合器震荡混匀后13000rpm离心3min，弃上清；沉淀加1000ul包被缓冲液，旋涡混合器震荡混匀后13000rpm离心3min，弃上清；沉淀再加1000ul包被缓冲液，旋涡混合器震荡混匀后13000rpm离心3min，弃上清；沉淀加300ul包被缓冲液稀释混匀；

3、I-ELISA检测：

1)上样：分别将上述制备好的包被缓冲液稀释混匀的样液加入ELISA酶标板反应孔，每孔100ul，同时设阳性对照用包被缓冲液1：50稀释、阴性对照用健康蔗汁制备和空白对照用PBST溶液，每个样品重复，盖上盖子，37℃恒温培养过夜；用含0.05％吐温的磷酸盐缓冲液慢洗2次，每次5min，拍干；

2)封闭：每孔加200ul含5％脱脂奶粉的PBST溶液，室温封闭30min，PBST缓冲液同上慢洗1次，拍干；

3)加抗体：每孔加100ul含0.1％ RSD特异性抗血清和含2.5％脱脂奶粉的PBST缓冲液，室温孵育1.5h，PBST缓冲液慢洗1次，拍干；

4)加酶标抗体：每孔加100ul含0.01％碱性磷酸酶标记羊抗兔酶标抗体、含2.5％脱脂奶粉的PBST缓冲液，室温孵育1.5h，PBST缓冲液慢洗5次，拍干；

5)显色：每孔加100ul底物/缓冲液，1mg/ml稀释，加入酶标板，室温下充分显色。

4、结果判别：

在BIO—RAD Model 550型酶标仪405nm波长下分别读取每个样品0小时和充分显色后的OD值。每个样品充分显色后的OD值减去0小时OD值的差大于0.15为阳性，小于0.05为阴性，在0.05～0.15之间为可疑。

本发明的有益效果是克服了传统的剖茎检测法和相差显微镜检测法准确性差、操作繁琐、灵敏度低，PCR检测法体系难于稳定等不足，能简便、快速、准确、有效的检测出病蔗样品中的宿根矮化病菌RSD，适合田间大批量样品的快速检测，为甘蔗宿根矮化病的诊断和防治、脱毒种苗的生产、对外甘蔗品种/材料交换检疫检测提供了技术支撑。

具体实施方式

1、样品蔗汁提取：