[发明专利]快速检测百合中南芥菜花叶病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物检验检疫技术领域，更具体地说，本发明涉及一种快速检测百合中南芥菜花叶病毒的方法。

背景技术

南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus ArMV)异名(Raspberry yellowdwarf virus，Rhabarber mosaic virus，Rhubarb mosaic virus)，英文名(Arabis mosaic nepo virus)，属于豇豆花叶病毒科(Comoviridae)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)成员，是我国二类检疫性植物病毒，病毒粒体为等径多面体，有三种沉降组分：外壳蛋白T(53S)、核蛋白M(93S)和核蛋白B(126S)，直径约30nm，为+ssRNA二分体病毒，主要通过汁液摩擦接种，种苗传播，也可通过介体线虫(Xiphinema diverslcan datum)传播。ArMV主要分布在比利时，保加利亚，捷克，丹麦、法国、德国、匈亚利、爱尔兰、意大利、卢森堡、荷兰、波兰、罗马尼亚、瑞典、瑞士、英国、新西兰、法国、日本、南非、加拿大、澳大利亚和新西兰等国家，ArMV寄主范围广泛，可以侵染约174属215种野生和栽培的单子叶、双子叶植物，主要属包括甜菜属、荠属，藜属、草莓属、大豆属、莴苣属、野芝麻属、番茄属、勿忘草属、碧冬茄属、车前属、早熟禾属、蓼属、大黄属、千里光属、繁缕属等。主要为害的作物有：草霉、啤酒花、芍药属、悬钩子、大黄属、接骨木、于甘菜、芹菜、水仙、欧洲女、辣根、三叶草、唐昌蒲属、辣椒、葛芭、唐菖蒲、郁金香、烟草、香石竹、水仙、蔷薇、以及一些其它的栽培品种和野生品种。在加上我国植被丰富，气候条件的多样性，使得适宜该病毒寄生繁殖的寄主植物和环境较多，由于ArMV侵染许多经济作物，一旦传入我国并定殖，将会给我国相关产业造成巨大的经济损失。ArMV主要表现为叶片斑驳、花叶、黄化褪绿、点斑、畸形(包括耳突)、矮化甚至坏死等症状，不同寄主上的症状表现不同，而且随株系、栽培品种、季节以及年份不同而变化。

目前，用于ArMV的检测和鉴定方法主要有生物学方法、血清学方法、电镜观察，其中以ELISA技术应用最为广泛，但存在着假阳性或假阴性现象，并且检测灵敏度不高，抗血清的制备比较困难，价钱昂贵，同时还需进行指示植物鉴别及致病力检测。其步骤繁杂，时间冗长甚至超出苗木存活容许的时间范畴等缺陷给检疫工作的顺利实施开展造成了一定的困难，已无法满足口岸检疫的需要。这是一个迫切需要解决的技术难题。现有技术中尚未发现相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，填补百合中南芥菜花叶病毒分子水平检测方面的空白，提供一种快速检测百合中南芥菜花叶病毒的方法。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

本发明提供了一种快速检测百合中南芥菜花叶病毒的方法，该方法采用以下步骤：

(1)利用NCBI中登录的南芥菜花叶病毒基因组序列，设计南芥菜花叶病毒特异性引物F1/R1，F2/R2，其中，F1/R1为外引物，F2/R2为内引物，F2/R2扩增片段在F1/R1扩增片段内部，F1/R1和F2/R2是巢式引物；

(2)采用RT-PCR和巢式PCR扩增。

本发明的工作原理及过程：

随着分子生物学技术的不断发展，基于核酸水平的高灵敏度RT-PCR方法已越来越广泛地应用于植物病毒的快速检测。但是，对于一些携带极其微量病毒的种子，种球以及其它无性繁殖材料，ELASA技术和普通PCR方法还远远达不到其所要求的检测灵敏度。巢式RT-PCR是建立在普通RT-PCR方法之上的具有更高灵敏度的分子检测方法，其原理是设计两对引物，其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上，通过第一轮RT-PCR一和第二轮PCR反应对某个基因进行检测。通常第一次采用能扩增较大片段的引物，经过25～35次循环扩增后，将第一次扩增的产物作为模板进行第二次扩增。本发明根据GenBank已公布的ArMV序列RNA2上编码CP蛋白的基因保守序列设计引物，建立了百合ArMV的巢式RT-PCR检测方法。引物序列为：F1：5′ACATTTCGCCACCCTAACTG3′，R1：5′TGCCAAACACCTGATGCTCC3′；F2：5′TGGCATAGTGGTTAGAGTTG3′，R2：5′GAAGGATGGCACAGTTAGAT3′。F1/R1扩增产物长度930bp左右，F2/R2扩增产物长度260bp左右。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果。