[发明专利]一种利用工程大肠杆菌制备游离脂肪酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备游离燃料脂肪酸的方法，具体地是一种利用工程大肠杆菌制备游离燃料脂肪酸的方法。

背景技术

生物柴油作为一种清洁的可再生能源，具有能量密度高、含硫量低、燃烧充分、润滑性能好等液体能源产品所期望的优良性能，成为优质的化石柴油的替代品已受到世界上许多国家的关注和重视。目前，国内外主要以植物、动物及它们的废弃油脂为原料，经过化学或酶法转酯反应合成脂肪酸甲酯等燃料酯。早在100多年前，Rudolf Diesel就利用植物油作为燃料(Shay，1993)。近年来，利用菜籽油、大豆、棕榈油以及各种油料作物所提取的油脂为原料，油脂含量约为30-60％，油脂精炼过程繁琐，提取工艺复杂(需超声波或化学法破壁)，生产成本高，产量低(David Pimentel，2005；韩明汉等，2006)。据报道，若以植物油脂来生产生物柴油，即使美国总土地的24％用于种植油料植物，也只能满足50％的燃料需求，2006年美国石化柴油平均价格为$0.49/L，而以棕榈油制得的生物柴油约$0.66/L，比石化柴油价格高35％，限制了生物柴油替代传统石化油的发展(Y.Chisti，2007)。从总体来看，这一路线存在的最重要问题和挑战，即是原料脂肪酸甘油酯的成本问题，原料成本占总生产成本的70％～85％，如油料植物的种植，占用了大量的耕地面积，且由于产量有限无法满足工业需求，较高的原材料成本使得生物柴油的价格远远高于传统柴油，这严重地制约了生物柴油的产业化进程。因此，低成本生物柴油的生产需要解决的前提是油质原料来源问题。微生物油脂是多种脂肪酸的混合物，其脂肪酸组成和植物油相近。利用微生物油脂为原料制备生物柴油在未来生物柴油产业中将发挥重要作用，是当今可再生能源领域技术研究的热点之一。与动、植物油脂相比，利用微生物制备油脂具有许多优点：微生物细胞增殖快，生产周期短；微生物生长所需的原料丰富(如淀粉、糖类、木质纤维类物质等)，价格便宜；能连续大规模生产，生产成本低；不受季节、气候变化的限制。微藻类是目前研究较热的产油微生物，油脂含量为细胞干重的50-80％，被认为是替代植物油脂生产生物柴油的首选(Miline et al，1990；Spolaore et al.，2006；缪晓玲等，2006)。在美国，总土地的1-3％用于生产藻类，就可以满足50％的燃料需求(Y.Chisti，2007)。但由于天然菌株不能高效合成脂肪酸，油脂产量有限，占用耕地面积大，生产成本偏高，且天然脂肪酸多为胞内分泌，必需从组织、细胞中分离后，才能用于生物柴油生产，这一过程关系到生物柴油的质量、成本。

随着现代分子生物学和生物化工技术的发展，对产油微生物茵种筛选、改良、代谢调控和发酵工程的研究日趋深入。通过基因工程手段，调节脂肪酸合成的相关酶的活性，增加脂肪酸合成，定向调控分泌形式，是利用微生物合成生物柴油的前沿技术问题，将降低微生物油脂生产成本，为未来生物柴油产业提供廉价原料。与天然菌株相比，大肠杆菌具有遗传背景清楚，易于工程调控，可高密度发酵，生长速度快等诸多优点，已经成为微生物催化合成化学品和燃料的理想受体菌。利用工程大肠杆菌生产燃料脂肪酸是不与作物争地、不靠天生产的生物柴油生产新途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用工程大肠杆菌制备游离脂肪酸的方法。本发明首次采用工程大肠杆菌制备燃料游离脂肪酸，提供了一条生物柴油生产新途径。

为实现上述目的，本发明提供的工程大肠杆菌制备游离脂肪酸的方法，步骤为：

A)将工程大肠杆菌按0.5-1.5％(v/v)的接种量接种到400-500mL内含30-50μg·mL^-1的卡那霉素或氨苄青霉素的LB液体培养液中，35-37℃，200-250rpm条件下进行培养至OD₆₀₀约为0.4-0.6时，再加入诱导剂IPTG至终浓度0.8-1mmol·L^-1，继续培养3-24小时，诱导表达目的蛋白；培养液在8000-1000rpm条件下，离心5-10分钟，取上清液；

B)发酵上清液，正己烷萃取，发酵液∶正己烷＝1∶2-4，减压浓缩，制得游离脂肪酸。

所述的方法，其中，步骤A的工程大肠杆菌，是以植物或其它产脂细菌中基因组DNA为模版，PCR扩增获得目的基因，酶切后，连接到pET载体上，转化到大肠杆菌中，筛选获得阳性重组质粒，重组质粒在大肠杆菌中表达后，获得工程大肠杆菌。

所述的方法，其中，步骤B中的正己烷通过减压后回收。