[发明专利]一种甘草查尔酮合成酶及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及查尔酮合成酶及其基因与应用，具体涉及到乌拉尔甘草(Glycyrrhizauralensis Fisch)中一个查尔酮合成酶基因及其在提高植物总黄酮含量中的应用，属于植物分子生物学领域。

背景技术

黄酮类化合物在植物界分布很广，在植物体内大部分与糖结合成苷类或碳糖基的形式存在，也有以游离形式存在的。天然黄酮类化合物母核上常含有轻基、甲氧基、烃氧基、异戊烯氧基等取代基。由于这些助色团的存在，使该类化合物多显黄色。

黄酮类化合物具有广泛重要的生理功能，是许多中草药的主要有效成分，普遍被应用于临床治疗和以黄酮类化合物为功能因子的保健食品中。在药学方面，目前已经有不少以黄酮类化合物起主要作用的中草药制剂，如安宫宁胶囊、双黄连注射液、雪莲注射液、银杏口服液等。也有黄酮类的提取物单独使用或添加到其他药物中发挥作用。如大豆提取物染料木黄酮对前列腺癌的多个细胞系具有明确的抑制作用；沙棘黄酮口服液能降低高脂而且症患者的总胆固醇、甘油三醇，极高密度脂蛋白含量，对高脂血症患者的临床总有效率为90％；橙皮(二氢黄酮苷)具有和芦丁相同的用途，也有维生素P样功效，是治疗冠心病药物“脉通”的重要原料之一；杜鹃素(二氢黄酮)是祛痰成分，临床用于治疗慢性支气管炎。在食品方面，黄酮类化合物可应用于食品中以增加其保健作用。一种是将富含黄酮类的原料直接加工成食品，如以富含黄酮类物质的植物叶部为原料，采用一般茶叶的炒制加工方法，制作出来的冲泡型叶茶：银杏茶、柿叶茶、核桃茶叶、桑叶茶等；或以黄酮类化合物来源的植物为原料制成液体饮料：复方沙棘饮料、黑米饮料。另一种是先从原料中提取出黄酮类物质，再把它添加到其它原料中进行加工制成产品。如银杏叶黄酮芒果汁保健饮料、灵芝杏叶保健饮料、二绿天然保健饮料、山碴酮酒等。

甘草是我国重要的传统中药，具有清热解毒、润肺祛痰、缓急止痛、补气益脾胃、调和诸药等功效，被誉为“众药之王”。甘草的主要有效次生代谢产物包括三萜类甘草酸和甘草黄酮，甘草黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗溃疡、抗衰老、保肝等药理作用，是一类天然抗菌剂和防腐剂。然而甘草野生资源的濒临灭绝阻碍了甘草的深入开发利用。

随着生物工程技术的不断提高，利用毛状根培养来生产次生代谢产物成为研究热点，其生长迅速，分支多，不需要外源激素，而且比细胞培养容易放大，是药用植物资源可持续发展的有效途径之一。但是甘草毛状根培养系统仍然存在活性成分低的问题，影响了甘草毛状根的进一步发展放大和工业化。如张荫麟等(甘草的发状根培养，中草药，1990，21(12)：23-26)报道乌拉尔甘草毛状根的总黄酮含量为干重的0.39％，远远低于生药根的含量2.38％；杜旻等(甘草毛状根培养系统的建立及化学成分分析，植物资源与环境学报，2001，10(1)7-10)研究的乌拉尔甘草毛状根黄酮含量也约为0.39％；王裔惟等(光果甘草毛状根培养过程中对活性氧清除能力和总黄酮含量的变化，植物资源与环境学报，2004，13(2)：6-9)检测光果甘草毛状根在生长31d后总黄酮达到最高含量为0.78％；杨世海等(甘草Ri质粒转化及不同理化因子对甘草毛状根生长的影响，中国中药杂志，2006，131(11)：875-878)检测了乌拉尔甘草毛状根中各种不同黄酮的含量，其总黄酮的含量约为0.15％。

甘草黄酮类化合物为次生代谢产物总黄酮的混合物，整个代谢途径十分复杂(Stefan M.，Axel M.(2005)，Flavones and flavone synthases.Phytochemistry，66：2399-2407.)。然而在此生物合成途径中，其下游的各种类型黄酮均来源于上游的同一骨架，即查耳酮。1分子4一香显酰-CoA和3分子丙二酰-CoA在查耳酮合酶(CHS)催化下产生查耳酮(苯基苯乙烯酮)。因此，查耳酮合酶是将苯丙烷类代谢途径引向黄酮类合成的第一个酶。查耳酮形成后经异构化反应转变成黄烷酮(Flavanone)，再经过不同的催化反应和修饰产生不同类型的黄酮类化合物包括黄酮(Flavone)、异黄酮(Isoflavone)、黄酮醇(Flavonol)、花青素(Anthocyanidin)(J B Harborne H Baxter·The Handbook of Natural Flavonoids·JohnWiley&Sons Chichester，1999//P)等，因此查耳酮骨架的形成决定了其下游各种黄酮类化合物的合成，是一个极其重要的限速步骤。也因此查耳酮合成酶(CHS)是整个代谢过程中最重要的关键酶。