[发明专利]一种琼脂糖凝胶微球及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程的生化分离和细胞及其药物载体领域。 

背景技术

琼脂糖是一种从海藻中提取的天然多糖，其水溶液在低温下具有形成水凝胶的特征。琼脂糖凝胶用作层析介质早在20世纪60年代就已经出现，它具有理想介质的许多特性：高亲水性、高度多孔性、含较多的可活化羟基、不与生物大分子发生非特异性吸附^[1]。由于琼脂糖上含有较多的可活化羟基，在一定的条件下可以接入不同的配基，作为亲和层析、疏水、反相和离子交换色谱的介质。随着研究与应用的不断深入，琼脂糖凝胶已实现多种生化物质的快速高效层析分离，分离对象涉及蛋白质、核酸、肽类、糖类等^[2]-[4]。琼脂糖凝胶除了作为分离介质外，还可以作为活细胞载体，如Shahab Lahooti^[5]等人采用琼脂糖作为羟乙基丙烯酸甲酯与甲基丙烯酸甲酯共聚物微球的内核物质包埋HEK细胞，琼脂糖凝胶的大孔网络结构一方面可以使细胞得到均匀分散，有利于营养物质和代谢产物的扩散，另一方面也起到了降低微球膜材的浓度，增加膜的通透性的效果，有利于足够的营养物质进入微球内供细胞生长。研究表明琼脂糖的加入有利于被包埋细胞活性的保持和细胞的分裂增殖，实验结果表明与没有琼脂糖相比14天后细胞增殖为其两倍多，这主要是由于琼脂糖凝胶不仅使细胞分散均匀，而且也起到了为细胞提供一种支持的底物的作用。Hiroyuki Hayashi^[6]等人采用琼脂糖制备了三层凝胶囊用来包埋B细胞线MIN6，研究结果表明与未包埋的MIN6相比，胰岛素的分泌速度增加了1倍多。 

目前无论是作为分离介质还是活细胞载体，琼脂糖凝胶微球的制备 方法主要有乳化冷凝法^[7]和喷射冷凝法^[8]-[9]，这些方法由于本身的特征在制备乳液时不能控制液滴的粒径，所制备的乳液粒径不均一，最终固化后得到的琼脂糖凝胶微球粒径都不均一。由于粒径不均一，在分离过程中小的凝胶珠会聚集到大凝胶珠之间的空隙中，使得分离压力增大，严重时导致分离无法进行。用于细胞包埋时粒径的不均一会使每个微球所包埋的细胞量不相同，在细胞生长过程中导致扩增速度不相同。另外，粒径均一的琼脂糖凝胶微球在研究凝胶的基本性质上也具有重要意义，粒径的不均一会使微球在表征时变得很复杂。另外这些传统的制备方法不能控制所制备微球的粒径。 

除了粒径不均一，传统的制备方法^[10]所制备的琼脂糖凝胶微球中琼脂糖含量大多在2wt％到6wt％之间，当微球中琼脂糖含量超过6wt％时，由于浓度增大导致水相粘度急剧增大，而传统的制备方法很难将粘度很高的水相均匀地分散到油相中形成均一的乳液，即使生成的液滴也容易并聚使生成的乳液粒径不均一。而高琼脂糖含量对于琼脂糖凝胶微球的应用有着很重要的意义。在生物大分子的分离纯化中，对分离介质的要求是能获得尽可能高的流速和尽可能高的分离效果，对于在生物分离领域已经广泛应用的琼脂糖介质，这种要求同样存在。然而琼脂糖的凝胶结构是由氢键相互作用形成的(在凝胶状态，多糖链通过链间氢键交错连接形成多孔的网状结构)，这种非共价键的结构使形成的凝胶强度较差。提高琼脂糖凝胶微球强度的途径有两个，其一是通过化学交联^[11]，即通过在多糖链上的羟基间引入共价键提高凝胶的强度。在交联效果相同的情况下，另外一条提高凝胶强度的途径是提高凝胶微球中琼脂糖的含量。提高琼脂糖含量的意义不仅仅提高凝胶强度，有时为了分离特定分子量范围的蛋白也需要高琼脂糖含量的凝胶微球，含量越高微球的孔径越小。鉴于传统的制备方法无法解决因为增大琼脂糖含量带来的水相粘度增大的问题，急需提出新的制备高琼脂糖含量凝胶微球的方法。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种琼脂糖凝胶微球，微球中琼脂糖含量超 过12wt％，最高可达20wt％，并且粒径非常均一。本发明的另一个目的是提供一种制备高含量的琼脂糖凝胶微球的方法。 

本发明的第一方面提供了一种琼脂糖凝胶微球，微球中琼脂糖含量超过12wt％，但小于20wt％，优选地，其按下式计算的微球粒径分布系数不大于15％： 

C.V.＝{[∑(d_i-d)²/N]^1/2/d}×100％ 

上式中，C.V.为粒径分布系数，d_i为各个凝胶的直径，d为数均平均粒径，N为用于计算粒径的微球的数量，且N≥200个。