[发明专利]一种以石榴皮为原料酶法制备鞣花酸的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种以石榴皮为原料酶法制备鞣花酸的方法。属食品、医药、化工领域。

背景技术：

鞣花酸(2，3，7，82tet rahydroxybenzopyrano[5，4，3cde]benzopyran—5，10—dione)，是广泛存在于各种软果、坚果等植物组织中的一种天然多酚组分，它是没食子酸的二聚衍生物，是一种多酚二内酯。它不仅能以游离的形式存在，而且更多的是以缩合形式(如鞣花单宁、苷等)存在于自然界。纯鞣花酸是一种黄色针状晶体，熔点(吡啶)大于360℃，微溶于水、醇，溶于碱、吡啶，不溶于醚。鞣花酸分子式C₁₄H₆O₈，分子量为302，其结构如下：

近十年来，由于发现了鞣花酸的抗突变、抗癌变效应，以及对化学致癌物质的抑制作用，引起了人们广泛的关注。

鞣花酸的制备方法主要有以下几种方法：

一种是从植物中提取鞣花酸。自然界中，红木莓、草莓、石榴以及蕨类等植物中含有少量鞣花酸(1％)。目前，国际上约有四五家工厂在以草莓、石榴为原料，可生产出含量为5％左右的天然鞣花酸提取物，用于食品添加剂；用此工艺可生产高纯度的鞭花酸，但由于原料成本较高、且原料中鞣花酸含量的限制而实际意义不大。

一种是通过倍酸(或其酯)的氧化聚合。没食子酸在过氧化物酶的氧化作用下，(见Nrusingha C.Mishra and Barry Gold.Synthesis of 13c-and 14c-labrleddllagic acid[J].Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals，1990，8：927-94)其主要产物是鞣花酸。此工艺过程中，鞣花酸的产率为20％～30％。但没食子酸(酯)的制备过程繁琐复杂，酶也需要精制纯化，而且产物中还有一种未知的醌类物质，其与鞣花酸的比例为1∶2.4，给产品的分离纯化带来了一定的困难，目前较少用此法进行鞣花酸的生产。

微生物法生产鞣花酸是利用橡碗单宁为原料，在发酵过程中产生鞣花酸，由于鞣花酸不溶于水，发酵过程中有大量的菌丝体产生，并且这种方法反应时间长，为后续的分离纯化带来了很大的困难。也不易于得到高纯度的鞣花酸。

发明内容：

本发明的目的是提供一种以石榴皮为原料酶法制备鞣花酸的方法。通过发酵获得含降解鞣花单宁的酶的菌体，经过超声破碎，得到粗的单宁酶，与石榴皮中提取的鞣花单宁发生酶促反应，分离纯化获得纯度较高的鞣花酸。实现降低成本，废物利用，提高鞣花酸产量和纯度的目的。

本发明的以石榴皮为原料酶法制备鞣花酸的方法，通过可降解鞣花单宁的单宁酶与鞣花单宁进行酶促反应，得到鞣花酸粗产品，经溶剂结晶纯化获得纯鞣花酸，具体步骤和条件为：

A鞣花单宁的提取

将烘干的石榴皮粉碎后，加入到体积浓度为20～60％的乙醇水溶液中，置于功率为80-100W的超声波作用下超声处理2-3次，每次25-40分钟，得到鞣花单宁的乙醇水溶液，浓缩回收乙醇后，得到鞣花单宁浓缩液；

B单宁酶的发酵培养

将黑曲霉Aspergillus niger3.316接种于发酵种子培养基中，25-30℃下培养20-24小时，移至产酶培养基中，25-30℃下培养4-6天，离心并用去离子水洗涤，获得含单宁酶的菌体，加入pH＝5.0的柠檬酸缓冲液后得到菌悬液，菌悬液于冰浴中在功率400-600W的超声波作用下进行20-30分钟超声破碎，得到粗的单宁酶；

C酶促转化反应

将步骤A得到的鞣花单宁浓缩液，加水稀释至原来体积的1-2倍，用NaOH水溶液调节pH至5.0-5.5，将步骤B得到的粗酶液加入其中，粗酶液与稀释后的鞣花单宁溶液的体积比为1：2-3，25-30℃下酶促转化反应40-48小时，反应液经过滤，得到粗鞣花酸产品；

D溶剂结晶纯化

将步骤C得到的鞣花酸粗产品加入甲醇，在70～80℃温度下萃取3～9小时后，将萃取液浓缩至饱和，降至室温结晶，反应液过滤后，滤饼经水洗、干燥，得到淡黄色鞣花酸产品，纯度为95％以上。