[发明专利]一种单细胞微生物的高效破壁方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及单细胞微生物的细胞破碎方法。

背景技术

微生物发酵在工业中发挥着巨大的作用，很多抗生素、酶类、有机酸、色素等均通过微生物发酵获得。特别是构建基因工程菌株，高效表达目的产物，已经成为人们大量获取有益产物的途径。由于微生物细胞壁组成和厚度差异很大，还没有一个对细菌和真菌通用的方法进行细胞破碎。通常采用酸碱破壁会造成污染，且易破坏拟提取的产物，化学法破壁对环境不友好，现有的压力破壁机(FrenchPress)效率极低，只限实验室使用，  且不适于酵母菌的破壁。而一些酵母菌需要采用蜗牛酶或纤维素酶辅助破壁，对一些壁厚的酵母菌作用不显著，常常需要根据情况混合不同的酶液，调整酶解条件，花费大，效率低，不适于大规模生产使用。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的在于针对上述不足提供一种高效快速的细胞破壁方法，既可达到100％破壁，又便于胞内产物的提取。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明的技术方案是采用高压匀质机对细胞悬液直接进行破碎。其包括步骤：首先将细胞制备成10～30％的细胞悬液通入高压均质机中，对于原核单细胞微生物而言，设置压力为60～90Mpa，对于真核单细胞微生物，则设置压力为90～150Mpa，流速为5～80升/小时，循环1～4次。当然，也可以将发酵罐中的发酵液直接加入高压匀质机，按照上述条件进行破壁。

具体地说，对于原核单细胞微生物，优选将其制备成20～30％的细胞悬液，通入高压匀质机，选择压力80Mpa，采用流速为7升/小时的高压均质机，循环2次，即可100％破壁。

对于真核单细胞微生物，优选将其制备成20～30％的细胞悬液，通入高压匀质机，选择压力120Mpa，采用流速为50-70升/小时，循环2-3次，即可100％破壁。

(三)有益效果

本发明建立了直接快速的单细胞破壁方法，发酵罐中培养的细胞直接进入破壁程序，无需经过离心-再悬浮混匀的过程，并且可保证目标物完好无损，破碎的细胞粗提液即可直接进入产物纯化的过程，减少了生产环节，节约了工作时间。本发明适用于所有单细胞微生物的破壁环节，其能够在发酵工业中提高工作效率，并且该方法无需任何化学药物辅助，显著降低生产成本，同时对环境无排放污染，可以广泛推广使用，经济效益不可估量。

附图说明

图1：磁螺菌破壁效果检测(60Mpa，20％细胞液，循环2次破壁后光学显微镜照片(×1000))；

图2：法夫酵母破壁图(120Mpa，30％细胞液，循环2次破壁后光学显微镜照片(×400))。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实验设备及其参数：

型号：NCJJ-7/200         型号：NCJJ-75/150

流量(L/H)：7             流量(L/H)：75

最大压力(Mpa)：200       最大压力(Mpa)：150

额定压力(Mpa)：180       额定压力(Mpa)：120

功率(KW)：0.75           功率(KW)：7.5

最大投入粒径(μm)：10    最大投入粒径(μm)：50

实施例1原核单细胞生物的细胞破碎

本例采用单细胞模式微生物趋磁螺菌(Magnetospirillumgryphiswaldense)为代表菌株，将发酵后的趋磁细菌从发酵罐中直接以管道通入高压均质机，设定好压力，流速为7L/h，循环2次后，细胞全部破碎，提取磁小体，经电镜观察，磁小体颗粒均匀，外膜完整，质量完好。表1是磁螺菌在不同条件下的破壁效果。图1是20％细胞液，在60Mpa压力下破碎后，经结晶紫染色后的结果。细胞破碎率达90％。

表1磁螺菌在不同条件下的破壁效果