[发明专利]一种新型的微生物培养基

说明书

发明领域

本发明一般地涉及细菌培养基的配比，该培养基特别是用于转化植物甾醇为雄烯二酮的增殖分枝杆菌属微生物的培养基。

背景技术：

雄甾4-烯-3，17-双酮(androst-4-ene-3，17-dione，简称：雄烯二酮或AD)是甾体激素类药物不可替代的中间体，对机体起着非常重要的调节作用。可以说几乎所有甾体激素药物都是以AD作为起始原料进行生产的。如用于生产性激素、孕激素、蛋白同化激素及皮质激素，又可用于合成氢化可的松，氧化泼尼松，黄体酮、雌烯醇、地塞米松等100余种药物，也是直接用于生产抗早孕药米非司酮和各类计划生育用药的必不可少的基本原料。如今AD不断被一些发达国家用于开发和生产新的医药主品，如福美司坦(Formestane或Lentaron)，等及类固醇类激素免疫抗原等，目前全世界范围内，AD的应用领域日益拓宽，用AD做原材料生产的医药品种不断增加。

由于化学全合成雄烯二酮成本较高，国内外很多科学家一直研究如何通过生物发酵方法得到雄烯二酮。50年代，美国Upjohn公司首先利用侧链上有双链的大豆甾醇和麦角甾醇为原料生产出雄甾-4-烯-3，17二酮(AD)及雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)并以此作为合成甾体药物的原料。近年来，由于甾体药物应用量逐年增加，人们的目光又转到在动植物界中含量较多的胆甾醇，谷甾醇，菜油甾醇等，并被认为是具有巨大潜能的甾体激素类药物的起始原料。20世纪60年代中期，由Sih等首先发现有些微生物可以选择性降解切除甾醇的饱和侧链而得到AD和ADD，70年代初，日本的有马启利用微生物降解胆甾醇生产ADD获得成功，受到许多制药公司的高度重视。为了大量生产类固醇激素，研究者试图使用甾醇为唯一碳源分离微生物和改变甾醇结构用作发酵的底物，并用能防止甾醇核降解的化学添加剂来提高类固醇的收得率，这一努力已获得很大进展(Marsheck等，Aplied Microobiology，23(1)：72～77，1972)。此外，埃及国家研究中心生物与天然产品化学系的和Sallam等研究发现，利用磷酸盐缓冲液调节底物培养基pH值5.5～7.38可提高生物降解AD、ADD的转化率。Upjohn公司在美国专利No.4,293,644中描述了一种通过分枝杆菌(ATCC 29472)的突变株从多种类固醇中得到以高产量的雄-4-烯-3，17-二酮(AD)为主，并有少量雄-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)的产物的方法。以后的研究发现节杆菌，诺卡氏菌和分枝杆菌等微生物均可用于直接切除甾醇的饱和侧链，在一定条件下得到AD和ADD，这使得微生物转化工业化生产成为可能。

由于生物发酵方法得到AD和ADD过程中主要依靠菌种，那发酵效果除了与菌种本身密切相关外，菌种在发酵过程中所使用的培养基也十分重要。目前常用的培养基主要使用的是糖蜜-Refiner糖蜜(BC糖)，如专利CN03804973中培养分支杆菌就是用得是该种糖蜜，但是甾醇发酵生产中种子培养基和发酵培养基使用的糖蜜-Refiner糖蜜(BC糖)，是生产甜菜糖厂的废糖蜜“Refiner’Smolasses”，质量很不稳定，年年都有变化，其质量的好坏直接影响转化率.这是一个有待解决的问题(杨英、姜绍通，微生物降解甾醇侧链转化雄甾-4-烯-3，17-二酮的研究进展，微生物学通报，2006年33(6)，145)。

分支杆菌(Mycobacterium sp.)是一种可以使植物甾醇发酵而得到雄甾-4-烯-3，17二酮(AD)及雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)的重要菌种，其发酵培养基也主要使用的是Refiner糖蜜，也存在上述问题。

发明内容：

本专利主要解决利用植物甾醇发酵得到AD和ADD过程中微生物培养基使用糖蜜造成的问题。通过大量的实验和研究，我们惊奇的发现，植物甾醇发酵得到AD和ADD过程中所使用的微生物在含有玉米浆和无机盐的培养基中能较好的生存并能将植物甾醇很好的转化为AD(D)，减少产物AD(D)含量上的波动，尤其是在针对分支杆菌、诺卡氏菌的培养基中尤为出色。

以下的详细说明帮助本领域技术人员实施本发明。然而，此详细说明并不解释为对本发明范围的过度限制。本领域普通技术人员可以对在此讨论的实施例进行修饰和变化而不背离本发明范围的精神。在本发明中，该营养培养基适用于植物甾醇生物转化为AD和ADD所涉及各种微生物，包括分枝杆菌和诺卡氏菌。本领域中还有许多已知和可用微生物，本发明并不限制于其中的任何一个。

发酵培养根据不同阶段分为三类培养基，一种是种子培养基，一种是生物转化培养基