[发明专利]细胞增殖相关基因CNKSR3与筛选方法及其应用

说明书

【技术领域】

本发明属于生物工程与生物医药技术领域。具体涉及基于细胞增殖相关siRNA干涉文库筛选细胞增殖相关基因CNKSR3的方法及其应用。

【背景技术】

人类基因组计划已经完成，但是人类染色体大多数基因的功能仍然不清楚。主要原因是缺乏能够大规模、高通量进行功能基因扫描的手段和策略。

Winzeler EA等人在啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组序列的测序成功之后，利用酵母基因敲除技术构建了大约6925株不同的精确敲除单个开放阅读框(open readingframe，ORF)(Brown，Dorfman et al.)的缺失型菌株，使得系统性地研究啤酒酵母基因组中这些开放阅读框的功能成为可能。而在模式生物线虫(Caenorhabditis elegans)和果蝇(Drosophila melanogaster)中，RNA干扰现象(Fire，Xu et al.1998；Kennerdell and Carthew1998)的发现使得在这些模式生物中对未知功能基因进行大规模功能缺失(loss-of-function)研究成为可能。

RNA干扰是转录后序列特异性的基因沉默过程(Tuschl，Zamore et al.1999)，由双链的RNA分子所介导(Zamore and Haley 2005)。目前研究证实：一种叫做Dicer的核酸酶能够切割长的双链RNA，产生19-29bp左右的短双链RNA，称为siRNA。siRNA的一条链作为RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)的模板同互补的mRNA结合，并使其被降解(Meister and Tuschl 2004)。

RNA干扰能够有效地抑制特定基因的表达，且这种干扰机制在哺乳动物中也广泛存在(Harborth，Elbashir et al.2001)。因此RNA干扰不但成为高等生物功能组基因学研究中的重要工具；也成为大规模、高通量地在哺乳动物细胞或者组织中进行功能缺失性(loss-of-function)扫描的主要手段(Miyagishi and Taira 2003)。

目前，利用化学合成的siRNA构建的RNA干涉文库，人们已经发现TRAIL诱导的细胞凋亡过程起到重要调节作用的基因家族(Ren，Wagner et al.2004)，以及同细胞生存相关基因(Murphy，MacKeigan et al.2004)、同内吞作用相关的激酶基因等(Pelkmans，Fava et al.2005)。

除了化学合成的siRNA，另一个方法就是构建以表达siRNA质粒为基础的RNA干涉文库，进行大规模高通量的基因功能研究和筛选。RNA干涉现象被发现不久，一些实验室就已经开始研究siRNA表达质粒。他们研究发现：RNA聚合酶III启动子序列的质粒，能够通过单一或者双向的RNA聚合酶III启动子序列，在真核细胞体内长期持久地表达shRNA(单一启动子)和siRNA(双向启动子)，并且无论是shRNA还是siRNA都能够有效地抑制特定基因的表达(Kaykas and Moon 2004；Miyagishi，Matsumoto et al.2004)。利用这一技术，Berns和他的同事们构建大约23,742个独立的shRNA表达质粒，这些质粒靶向人类7,914个不同基因。并且通过在人类细胞中进行大规模的扫描，他们发现了1个已知功能和5个未知功能基因，这些基因可能在依赖于p53引起的细胞周期阻滞起着重要调节作用(Berns，Hijmans et al.2004)。Kaykas和他的同事们也证实：由他们构建完成的pHippy的双向启动子siRNA表达载体能够有效地沉默连接了荧光素酶报告基因的PGL3基因(Kaykas and Moon 2004)。

因此，利用siRNA干涉文库对新功能基因进行扫描，是发现新功能基因的重要手段。

利用双向启动子的siRNA表达载体，我们组建了靶向人类胚胎干细胞和造血干细胞增殖、分化相关基因的siRNA干涉文库。目前，我们的文库含有近450个载体，靶向225个人类基因。我们利用一部分文库(包含70个基因(20个转录因子，50个未知功能蛋白))对细胞增殖相关基因进行新功能基因的筛选(Ghildiyal，Seitz et al.2008)。并发现了能够影响细胞增殖的新功能基因—CNKSR3