[发明专利]磷脂酰丝氨酸合成酶催化合成磷脂酰丝氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种磷脂酰丝氨酸合成酶催化合成磷脂酰丝氨酸的方法。

背景技术

磷脂酶D，即磷脂酰胆碱磷脂水解酶(EC3.1.4.4)，属于催化磷酸二脂酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称，其主要生理功能是参与细胞脂质代谢、信号转导及生物膜形成等。

磷脂酰丝氨酸合成酶(phosphatidylserine synthase，PSS)是磷脂酶D家族成员之一，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，目前在细菌、酵母和哺乳动物细胞中均有发现。其中，源自大肠杆菌的磷脂酰丝氨酸合成酶具有该家族明显的序列特征，即含有两个间隔出现的H(x)K(x)₄D保守序列，它能够催化合成大肠杆菌自身所需的大部分磷脂类物质，而不同于其它革兰氏阴性菌的磷脂类物质合成酶，并不紧密连接于细胞膜结构。对其进一步定位研究发现，该酶是一种外膜蛋白，主要通过脂类底物和弱酸性磷脂物质的电子传递链与膜表面互相作用。

但是磷脂酰丝氨酸合成酶(PSS)在大肠杆菌中含量低(不到蛋白总含量的0.1％)，不利于直接工业化发酵生产；而枯草芽孢杆菌表达系统是一种较为理想的异源蛋白表达系统，可以高效地表达具有生物活性的异源蛋白并将其分泌到培养基中，且具有较高的生物安全性。本发明采用枯草芽孢杆菌系统表达磷脂酰丝氨酸合成酶基因，解决了出发菌株磷脂酰丝氨酸合成酶(PSS)表达量低的问题，适用于工业化生产。

磷脂酰丝氨酸合成酶具有水解和转酯双重活性，既可水解卵磷脂(PC)形成磷脂酸(PA)和胆碱；又可在高浓度丝氨酸、乙醇胺等亲核物质存在下，催化转酯反应生成具有不同极性头部的稀有磷脂——磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)等。应用同位素标记技术对酶的反应机理研究发现，该酶表现出ping-pong反应机制，在水相和底物积聚相的相界面对底物进行“修饰”。

磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)是一种天然的磷脂，于1942年由Jordi Folch首次提取并加以定性，它并非单一成分，而是一组化合物。磷脂酰丝氨酸的结构决定了其具有双亲性的独特性质，带有负电荷的一端具有亲水性(或水溶性)，由脂肪酸组成的另一端具有亲脂性(或脂溶性)。作为磷脂家族中的一员，它是唯一能够调控细胞膜关键蛋白功能状态的磷脂，有着独特的理化性质和营养价值：(1)提高认知能力，特别是识别、学习、记忆能力；(2)改善阿尔茨默氏症(Alzheimer’S Disease)；(3)治疗抑郁症；(4)缓解精神压力和身体疲劳。

目前工业化生产磷脂酰丝氨酸的主流方法是采用浸提法，存在选择性不高、易引入其他杂质、无法获取纯的磷脂酰丝氨酸等问题；而化学合成法生产磷脂酰丝氨酸也不能达到实际生产要求。利用磷脂酰丝氨酸合成酶的高度专一性，催化卵磷脂和丝氨酸制备磷脂酰丝氨酸，有望改变目前在生产磷脂酰丝氨酸上存在的问题，为工业化定向生产高纯度磷脂类物质奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种选择性高，最终产物杂质少、纯度高的磷脂酰丝氨酸合成酶催化合成磷脂酰丝氨酸的方法。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种磷脂酰丝氨酸合成酶催化合成磷脂酰丝氨酸的方法，包括以下步骤：

(1).将磷脂酰丝氨酸合成酶酶液加入含有丝氨酸、CaCl₂、Triton-X100的醋酸缓冲液中，然后与含有卵磷脂的氯仿溶液混合，在28～32℃条件下磁力搅拌反应3～5小时；

(2).反应结束后双液相自然分层，提取有机相备用；

(3).有机相自然挥发后，剩余物经氯仿洗涤得到磷脂酰丝氨酸。

而且，所述的磷脂酰丝氨酸合成酶酶液与醋酸缓冲液的体积比为1∶50。

而且，所述的步骤(1)中的丝氨酸的浓度为3.4M。

而且，所述的步骤(1)中的CaCl₂的浓度为20mM。

而且，所述的步骤(1)中的Triton-X100的浓度为0.375％。

而且，所述的步骤(1)中的醋酸缓冲液的pH为7.0。

而且，所述的步骤(1)中的卵磷脂的浓度为17.0mM。

而且，所述的步骤(1)中的醋酸缓冲液与氯仿溶液的体积比为1∶1。

本发明的有益效果和优点：