[发明专利]CEA正调控IL-15肿瘤免疫基因治疗质粒载体及应用

说明书

【技术领域】：

本发明属于基因工程领域，具体涉及癌胚抗原(CEA)阳性肿瘤的免疫基因治疗载体的构建和应用。

【背景技术】：

基因治疗是近十几年来随着现代分子生物学技术的发展而诞生的新的生物医学治疗技术。基因治疗是通过特定载体将具有治疗作用的基因导入细胞的治疗方法。基因治疗载体包括病毒载体和非病毒载体。质粒载体是非病毒载体的一种，具有制备简单，易储存，安全的特点，但质粒载体的体内基因表达效率转染效率低，靶向性差，为其缺点。

细胞因子免疫基因治疗是基因治疗的重要策略之一，在肿瘤治疗的研究中受到广泛重视。细胞因子基因转导可对肿瘤微环境产生影响，比单纯给予外源性细胞因子治疗的不良反应小，并可以在细胞局部持续性表达高浓度的细胞因子，刺激或增强机体的特异性抗肿瘤免疫反应，使肿瘤生长受到抑制，达到肿瘤治疗的目的。多种细胞因子，包括IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-7，IL-10，IL-12，IL-15，IL-18，IL-21，IL-24，IL-27，IFN，TNFα等都已应用于肿瘤治疗的临床前实验研究，其中IL-2，IL-12，IL-21，IFN，TNFα等已进行了临床试验研究。动物实验结果表明多种细胞因子可以增强抗肿瘤免疫反应而抑制肿瘤生长，但临床试验中的效果还不理想。质粒载体体内基因表达效率低和靶向性差的缺点是影响其临床效果的因素之一。大多数细胞因子表达载体使用CMV启动子调控目的基因的表达，CMV启动子也被认为是目前表达效率最高的启动子之一，但CMV启动子在体内易被灭活，使其效率降低，同时其调控的基因表达无组织特异性，限制了应用。

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是最早被发现和鉴定的肿瘤相关抗原之一，90％左右的消化道恶性肿瘤表现为CEA阳性。CEA在肿瘤细胞的表达受特异性调控序列-CEA启动子的调控。CEA启动子在某些肿瘤细胞，尤其是结直肠癌细胞中具有良好的特异性，因此，通过CEA启动子调控目的基因在消化道肿瘤中靶向性表达成为可能，但CEA启动子的活性较弱，其直接调控治疗基因表达难以使外源性治疗基因、尤其是细胞因子的表达达到治疗水平。

【发明内容】：

本发明目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种CEA正调控IL-15肿瘤免疫基因治疗质粒载体、构建方法及应用。实现细胞因子基因在CEA阳性细胞中的高效表达，以达到对CEA阳性肿瘤靶向免疫基因治疗的目标。

本发明构建了一种以白细胞介素-15(Interleukin-15，IL-15)为治疗基因、CEA启动子正调控IL-15基因高效表达、对CEA阳性肿瘤靶向免疫基因治疗的质粒载体。

本发明提供的CEA正调控IL-15肿瘤免疫基因治疗质粒载体，具有序列表中序列1所示的基因序列。可应用在人肿瘤免疫基因的治疗中。用于人肿瘤免疫基因的治疗药物的开发。

本发明的质粒载体为pHi2-sIL15-CEA-TAT(图1)，在该质粒中，HIV2启动子控制IL-15基因表达，CEA启动子控制HIV反式转录因子TAT表达，TAT表达作用于HIV启动子，增加其效率，从而实现对IL-15表达的正调控。同时，该质粒中IL-15基因的信号肽被IL-2信号肽替代，更进一步以增加IL-15表达效率。

本发明以细胞因子IL-15作为治疗基因。IL-15是一个多功能的细胞因子，对天然免疫和获得性免疫反应都有重要的调节作用。IL-15可以促进中性粒细胞、巨噬细胞的活性，对树突状细胞的功能起关键作用。另外，IL-15促进淋巴效应细胞，尤其是NK细胞、NKT细胞和CD8+T细胞的产生、激活、归巢和存活。IL-15可以抑制IL-2诱导激活引起的细胞死亡。IL-15对记忆性T细胞的存活和增值起关键作用，其可以调节记忆性T细胞的稳态增值，维持其数量。因此，IL-15被认为是非常有潜力的可用于免疫治疗的细胞因子。实验证明应用IL-15可以促进过继性转移的肿瘤特异性T细胞的存活并增强对肿瘤的排斥，通过基因工程方法表达IL-15的肿瘤细胞在体内生长缓慢、转移能力下降。最新资料证明IL-15可以使处于免疫耐受状态的CD8⁺T细胞重新增值并恢复免疫功能。本发明中所用IL-15基因购自Invitrogen。

本发明以CEA启动子驱动反式转录因子TAT的表达，再通过TAT增强HIV启动子活力，从而间接实现CEA启动子对HIV启动子所驱动的目的基因的正调控。