[发明专利]采用球形节杆菌生产17α－去氢甲基睾丸素的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物制药及医药工程领域，具体涉及一种采用球形节杆菌生产17α-去氢甲基睾丸素的方法，该方法是以球形节杆菌为菌种、17α-甲基睾丸素为底物并采用微生物C_1，2位脱氢转化生产17α-去氢甲基睾丸素的方法。

背景技术

17α-去氢甲基睾丸素(Dehydro-17α-methyltestosterone)即美雄酮(Methandienone)，其化学名为：17α-甲基-17β-羟基雄甾-1，4-二烯-3-酮(17β-hydroxy-17α-methylandrosta-1，4-dien-3-one)，结构式如下图所示，是一种雄性激素及蛋白同化激素，与17α-甲基睾丸素相比具有同化作用强，雄性样作用小的特点，而且还可作为其它甾体激素的原料中间体。17α-去氢甲基睾丸素能促进蛋白质合成，抑制蛋白质的异生，维持正氮平衡，使食欲增进、肌肉增长、体重增加，还可以促使钙、磷在骨组织中沉积，促进骨细胞间质形成，加速骨钙化和骨生长，同时可促进组织新生和肉芽形成，加速创伤的修复。临床时适用于慢性消耗性疾病，严重感染，创伤、烧伤、手术后等的康复，以及纠正应用肾上腺皮质激素引起的负氮平衡，骨质疏松，小儿发育不良，侏儒症等，并能促进早产儿及未成熟儿的生长，在治疗骨折不易愈合、高胆固醇血症、产后衰弱等病症时亦可使用。

目前，工业上多采用化学合成的方法生产，收率较低，且对环境及操作人员都有很大危害；也有采用简单节杆菌(Arthrobacter simplex)为生产菌株来催化17α-甲基睾丸素C_1，2位脱氢得到17α-去氢甲基睾丸素的研究，如中国专利CN 1563409A公开了微生物转化法生产美雄酮的制备方法，采用简单节杆菌经菌种悬液的制备、一级种子培养、二级发酵培养、底物转化和产物的分离提取；通过控制培养期和转化期的相关工艺，并采用GIRARD试剂特异性的分离产物美雄酮和底物17α-甲基睾丸素。该方法工艺步骤沉长，引入化学试剂较多，难于保证质量，成本高，投料浓度低，转化效果差，这限制了大规模工业化生产。因此，研究和开发一种收率高、工艺简单、经济实用且对环境和操作人员安全的生产方法，对用生物转化法生产甾体药物有着非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种收率高、工艺简单、经济实用且对环境和操作人员安全的17α-去氢甲基睾丸素的生产方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种采用球形节杆菌生产17α-去氢甲基睾丸素的方法，其生产方法的步骤是采用球形节杆菌为菌种，经一级种子培养、二级发酵培养，在制成的菌体发酵液中投入17α-甲基睾丸素进行C_1，2位脱氢转化，转化完成后，过滤，收集滤饼，即可制得17α-去氢甲基睾丸素。

而且，所述的球形节杆菌由美国典型微生物菌种保藏中心保存，其编号为ATCC 31250。

而且，所述的球形节杆菌的一级种子培养的方式是：将球形节杆菌在琼脂斜面上培养，28～32℃下恒温培养1～2天，3～5℃保藏待用，保藏时间在15～25天；再将球形节杆菌作为生产菌种从斜面接一满环至种子培养基中，在旋转式摇床上160～180r/min转速、在30～33℃温度条件下培养18～22小时，得到适于接种的种子培养液。

而且，所述的球形节杆菌的二级发酵培养的方式是：将种子培养液按3～6％体积比的接种量接入到发酵培养基中，在发酵过程中控制摇床转速为160～180r/min，在30～33℃温度条件下培养18～24小时，得到菌体发酵液。

而且，所述的在制成的菌体发酵液中投入17α-甲基睾丸素进行C_1，2位脱氢转化的方式是：将17α-甲基睾丸素粉碎研细，粒度为14～16μ，无菌条件下投入到菌体发酵液中，投料量为5～8g/L，再在菌体发酵液中加入亲水性有机溶剂3～5％体积比助溶，得到17α-去氢甲基睾丸素发酵液。

而且，C_1，2位脱氢转化过程中的转化条件是：控制摇床转速为180～200r/min，在30～35℃温度条件下转化40～50小时，转化完成后，通过高效液相色谱法来测定转化率。