[发明专利]用于细胞识别与分离的抗体－金壳铁核磁纳米粒子合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子合 成方法。

技术背景

相对于单一金属纳米粒子，双金属纳米粒子同时具有两种材料的优点， 因而有更广泛的应用领域。其中生物分子修饰的金壳铁核磁纳米粒子以其 独特的生物相容性、光学和磁学性质可以对细胞进行实时、动态的观测， 因此已有一些研究将DNA，蛋白、抗体通过多聚物分子与金壳铁核磁纳 米粒子连接利用纳米粒子的光学与磁学性质来实现特定细胞识别与分离 (科学，Science，2006，312，1027-1030；生物聚合体化学，Bioconjugate Chem. 2004，15，482-490)。然而，在这些研究中，主要利用聚赖氨酸或牛血清蛋 白复合物等来稳定纳米粒子，再进一步通过共价键反应结合DNA，蛋白、 抗体等功能分子，合成过程复杂，需要较长的反应时间(生物聚合体化学， Bioconjugate Chem.2004，15，482-490)，并且难以克服非特异性吸附使检测 的选择性降低。应用多肽修饰的金纳米粒子，可以使纳米粒子在水溶液中 保持高稳定性(美国化学会志，J.Am.Chem.Soc.，2004，126，10076-10084)， 并容易通过修饰生物素应用生物素-亲和素反应结合DNA，蛋白、抗体等 功能分子，实现特异性识别(美国国家科学院院刊，Proc.Natl.Acad.Sc.U. S.A.2006，103，1215-1220)。表皮生长因子受体抗体能通过特异性识别与肿 瘤细胞膜中过表达的表皮生长因子受体作用而区分正常细胞与病变细胞。 因此，将表皮生长因子受体抗体与胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬 氨酰甘氨酰赖氨酰-生物素-甘氨酸修饰的金壳铁核磁纳米粒子相结合获得 抗体-金壳铁核磁纳米粒子对实现细胞识别与分离有一定意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有细胞识别与分离功能的抗体-金壳铁核 磁纳米粒子合成方法。

生物素修饰的胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨 酰-生物素-甘氨酸与金原子有很强的亲和性，能够在金壳铁核磁纳米粒子 形成致密的保护层，使磁纳米粒子溶于水溶液并保持长期的稳定性且能与 亲和素反应。表皮生长因子受体抗体能与特定肿瘤细胞膜中过表达的抗原 表皮生长因子受体相互作用，实现细胞识别。本发明结合这两种生物分子 的优势，优化合成条件，成功实现了对细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁 纳米粒子。并且纳米粒子表面表皮生长因子受体抗体的含量可以通过反应 液中表皮生长因子受体抗体和蛋白A的配比调控。

实现本发明的方法的具体的技术方案如下：

按照Lyon方法，先利用10毫升浓度为3.0摩尔/升的氢氧化钠与10毫 升浓度均为10毫摩尔/升氯化亚铁和氯化铁混合液相互作用获得四氧化三 铁，进一步用10毫升0.02摩尔/升的硝酸在100℃下反应1小时获得三氧 化二铁，冷却。在室温下将10毫升溶液含有质量浓度为1％氯金酸，5毫 摩尔/升的柠檬酸钠和0.2摩尔/升的盐酸羟氨的混合液分10次，每次间隔 10分钟加入所制备的三氧化二铁溶液，获得金壳铁核磁性纳米粒子。其粒 径为60纳米。

将多肽胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰-生 物素-甘氨酸与金壳铁核磁性纳米粒子按摩尔比1×10⁵至5×10⁶的配比范围 配制成水溶液，在室温下静置反应1小时后，10000rpm离心后抛弃上清液， 获得多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子。

配制亲和素修饰表皮生长因子受体抗体和亲和素修饰的蛋白A摩尔比 为1∶0.111-99.9的混合物，将多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子与亲和素 修饰表皮生长因子受体抗体和亲和素修饰的蛋白A的混合物，按摩尔比为 1∶1×10³-5×10⁴配制成pH值为7的磷酸缓冲溶液，在室温下静置反应1小 时后，10000rpm离心后抛弃上清液，再加入1000微升pH值为7磷酸缓 冲溶液，获得表皮生长因子受体抗体-磁纳米粒子溶液，再10000rpm离心 后抛弃上清液，真空冻干，获得用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳 米粒子。

该纳米粒子可以在-80℃存储6个月不变性。