[发明专利]聚乙二醇修饰的三价铁亚血红素短肽化合物及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯衍生物修饰的亚血红素短肽化合物及制备方法。

发明背景

亚血素六肽(Deuterohemin-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys，DhHP-6)是以微酶和天然抗坏血酸过氧化物酶结构为依据，设计的一种含亚血红素的短肽，是一种较好的过氧化物酶模拟物。该短肽模拟酶分子量小于3000，可发展成高效的抗氧化药物。但是，其生物利用率低，易受蛋白酶降解。

单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯的衍生物，是以聚乙二醇为主链，并具有一个甲氧基端基和一个活化的琥珀酰亚胺酯端基的高分子化合物。其中，聚乙二醇(PEG)是一种亲水性、生物相容性的无毒聚合物，其通式为H(OCH₂CH)_nOH其中n≥4，其分子量为200至20000道尔顿不等。美国食品药品管理局(FDA)已经批准了PEG作为辅料，在食品，化妆品，及静脉注射，口服和经皮给药等药物产品中的应用。同时，其能通过肝肾途径排出体外的特性，使其成为极为理想的药用辅料。大量研究证明：单甲氧基化形式的PEG与蛋白质和/或肽化学偶联后，能显著延长后者的生物作用，许多PEG-蛋白和/或肽偶联物能够避免被蛋白酶酶解，而且/或者能使自身的免疫原性降低。PEG及其衍生物作为药物制剂的载体已经在很多商业药品中得到了广泛的应用。

制备蛋白质和/或肽和聚乙二醇结合物的最常用的方法是利用PEG活化后形成的亲电子基团和蛋白质/多肽上的氨基进行反应，反应后可以在一个蛋白/多肽分子上共价连接数个聚合物链，聚合物链的数目取决于蛋白质/多肽上可供结合的位点数、修饰剂的化学性质，修饰剂的过量比例及反应条件。

发明内容

本发明的目的在于将亚血红素六肽(DhHP-6)用聚乙二醇(PEG)修饰，提供一种聚乙二醇修饰的三价铁亚血红素短肽化合物及制备方法。DhHP-6分子，有如下结构式(I)：

本专利采用的是目前广泛应用且已商品化的活化聚乙二醇衍生物，聚乙二醇的结构式如下(II)：

本专利采用的活化聚乙二醇衍生物的结构通式如下(III)：

其中聚乙二醇(PEG)的重均分子量为2000-20000(相对应的，44≤n≤447)，k＝0～3，(聚乙二醇的分子量过小，其在体内的代谢产物可能对人体有害，太大不利于修饰，同时可能导致肽类药物失活)；    

通过亲核取代反应，制备一种聚乙二醇修饰的亚血红素六肽，其结构通式如下(IV)：

R代表去除一个氨基(NH₂)的DhHP-6分子，具有如下结构(V)：

本发明描述的PEG修饰的DhHP-6的制备方法如下：

将DhHP-6溶于去离子水中配制成0.5～5mg/ml的溶液，向其中加入pH为5～8的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，稀释至5～10倍体积，然后加入聚乙二醇衍生物或10～40mg/ml聚乙二醇衍生物的乙腈(ACN)溶液，反应温度为0～25℃，反应中聚乙二醇衍生物与DhHP-6的摩尔比为5～20∶1，反应时间为0.5～4小时，反应结束后用甘氨酸终止反应，通过反相高效液相色谱接出PEG修饰的DhHP-6洗脱峰，在40℃下减压下旋转蒸发至无明显气泡产生，将残液冻干，即可得PEG修饰的DhHP-6固体。

反相高效液相色谱柱的流动相为A：H₂O(含0.5％三氟乙酸(TFA，v/v))，B：90％的乙腈水溶液(含0.5％三氟乙酸(TFA，v/v))；浓度梯度为B相40％～60％，时间为40分钟，(浓度由机器本身控制，初始状态时，水与乙腈的体积比为6∶4，实验过程中，机器在设定的时间内，这里是40分种内将自动升高乙腈相体积比并降低水相体积比，)，其中11分钟左右出现的洗脱峰为DhHP-6峰，15分钟左右出现的洗脱峰为PEG修饰的DhHP-6的峰。

制备反应如下式进行：

其中R-NH₂代表DhHP-6，聚乙二醇(PEG)的重均分子量为2000～20000(44≤n≤447)，k＝0～3，R代表去除一个氨基(NH₂)的DhHP-6分子；

前文所述的聚乙二醇衍生物是本领域技术人员所熟知的，包括：甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯或丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯等。

本发明的优点在于：

1.本发明所述的修饰方法简便。反应在室温下既可进行并且具有较高产率。