[发明专利]用于山茱萸品种鉴定的DNA片段及其制备方法

权利要求书

1、一种用于山茱萸品种鉴定的DNA片段，其特征在于，该片段为10条5对DNA片段，它们是：

P1/P2：5′CTTGTCTGTGGATGGT 3′/5′GTGTGGATTTTATTGG 3′；

P3/P4：5′TAGCCCGAGGTGTTCT 3′/5′TCTTGTTCCCGTTGTT 3′；

P5/P6：5′TCGGTGTGTTGAGTATTGGC 3′/5′TCGTTGTTTTTTATGCTGGT 3′；

P7/P8：5′TGTGGCAGGGACTTCA3′/5′GCATCAGCAAAAACGG 3′；

P9/P10：5′CGACAAGTGGTGGTTGAGACG 3′/5′CACGCACGACAGGACGCT 3′。

2、权利要求1所述的用于山茱萸品种鉴定的DNA片段的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

A、提取DNA，方法是：

(1)将山茱萸植物叶片0.2g放入研钵，加入叶片重量的10％PVP粉末，在液氮中研磨成细粉；

(2)将细粉装到1.5ml离心管，加入冷藏的提取缓冲液1200μl，冰上放置10min，8000r/min离心5min，弃去上清液，加入用Vc+2×CTAB制成的抽提液600μl，再加入50μl β-巯基乙醇，混匀后成混合液，65℃，保温4h，其间不时摇动；

(3)将上述装有混合液的离心管取出，4℃，12000r/min，离心15min；取上层溶液，加入等体积的由饱和酚、氯仿和异戊醇组成的液体混匀，4℃，12000r/min离心10min，取上层溶液，然后加入等体积的由氯仿、异戊醇混合制成的液体，其氯仿∶异戊醇＝24∶1，在4℃，12000r/min离心10min，重复抽提2次，去其杂质成抽提液，所说的饱和酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1；

(4)将上述抽提液，加入0.6～1.0倍体积的异丙醇，放置10到30min，生成含有沉淀物的溶液；

(5)将上述含有沉淀物的溶液，于4℃，12000r/min离心15min；收集沉淀物，加入300μl 75％乙醇洗涤沉淀，12000r/min离心5min，弃上清液，再加入300μl 75％乙醇洗涤沉淀，12000r/min离心5min，重复洗涤1次，得到沉淀物；

(6)将装有沉淀物的离心管置于真空干燥器中5～10min，抽干乙醇；用50μl去离子水溶解DNA沉淀物，-20℃冰箱保存备用；

B、制备RAPD片段，方法是：

将上述用去离子水溶解的DNA沉淀物，置于反应体系中进行反应，方法是：用10×buffer 2.5μl，dNTP 3.0μl，Mg²⁺3.0μl，引物2.5μl，DNA沉淀物3.0μl，Taq酶1.0μl，去离子水10.0μl补足25μl成反应体系，94℃预变性8min，变性94℃，1min；退火38℃，1min；延伸72℃，1.5min，如此反复35个循环，72℃放置10min，得产物，对产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，0.5μg/ml溴化乙锭溶液染色，利用S37、S43、S92扩增的图谱，切掉目的DNA的条带，得RAPD片段ST37、ST43、ST92；

C、对RAPD片段进行克隆，方法是：

首先用PCR产物克隆试剂盒将将RAPD片段ST37、ST43、ST92分别连接到pUCm-T载体中，16～23℃连接1小时至过夜，得到连接产物；将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，再在含有IPTG、X-Gal、Amp的LB琼脂培养基平板上隔夜培养，形成白色单菌落，然后将单菌落在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜，得到含有目的DNA片段质粒载体的菌液；取菌液进行RAPD片段的DNA序列进行测定，得ST37全长589bp，ST43全长825bp，ST92全长837bp三个全序列片段，它们是：

ST37的全序列-589bp：

1   CTTGTCTGTG GATGGTGCTC GGTACCGTAA TACGACTCAC TATAGGGCGA CATATGATCG ATGATATCCC ATGGGCGGCC

81  GCCTGCAGAC CAGGTCTGAC CGCTTGTCTG TGGATGGTAA GCAAGGGTGA CTTTATGGGT CACACCGTAC TTTTTCATCA

161 AAGCTTCAAA TGATCTATTG CAGAAATATT TTCCTCCATC ACTAATGATA GCCCGAGGTG TTCTAAATCT AGGTAAGACA

241 TTGGTTTTGA GAAATTCAAT GACCACAACA TGGTCGTTTG TCTTACACAC AATAGCTTCG ATCCACTTAG ATACGTAATC

321 TACAGCGACA AGAATATACA AATTACCGAA AGAGTTGGGG AAAGGTCCTA TGAAATCAAT GCCCCAAACA TTGAAGATTT

401 TGATGATTAG AATTCGATTA GGTGGCATCA TATTTCATTT GGAAATGTTT CATAATAGTT AACAACGGGA ACAAGACTTA

481 CAATAAAGCT TGGTATCCTT AAATATGGGG GGCCAATAAA ATCCACACTG CAAAATTTTT GCAGCAATTC TATGATCACT

561 AAAGTGGCCT CTAGTGTGGA TTTTATTGG；

ST43的全序列-825bp：

1   TAACCCGGCA GTTGTAATTC GAGCTCGGTA CCGTAATACG ACTCACTATA GGGCGACATA TGATCGATGA TATCCCATGG

81  GCGGCCGCCT GCAGACCAGG TCTGGTGATC TTGATTCCTT CCTGCAAGTC ACCTGCTGGC ATGATGTCTT GTTGCAGTGA

161 TGATGTTTGT CGTTGGTTGC TGTGAGATCT TGTTATCCCC TGACTCCTCT AAACATCGTA CCAGGAAGCA TTAAGTGGTG

241 TGGGGGCTGG GCCTGCTTAC GAATGAACTT AACTTTATTT GCTGTGTTGT TATCGCTGCC CTCTTTGCAC TCAGAAAAGC

321 CGTGTTGGCA TCTGTATTGA TTAAGCCGCC CCGACACGAG AATCGGTGTG TTGAGTATTG GCTCTTCCTC CGCTTCCTTA

401 CTCGCTTACC TGCTGCGCTT CGTTCTGCTG CTGCGAGCAG CGTCATCATC TTAGAAAGAT GCAGTAATGT TATTATCCAC

481 ATCATCAAAT AATAACGCAA GAAACAACTT ATGAGCAGAT CGTCATAAGG ACCCCAGCCA CCGAAACGAG GCGTCGCTGC

561 TGCTTTTATT CCATAGCCTC CGCCCCGCTG ACCAGCATAA AAAACAACGA TCCTAAACCA CGTGGCGCCC CCACCCTGGC

641 TCTTACTATG ATGCTTCTCT GTTTCTCCTG TAGAATAGCT CCGTCGTGTG TTCTGAAGCT ACGACGCTGA CTATCAAAGA

721 AATACCTCTC CTTCTTTCTC CCTTCAGGAG GCGCGGTTCT TTTTCATACT GACTGTGGAT TTAAACCTCT GCATCTGCAG

801 GACACCCCTG CCTTTTGGGC TTGTT；

ST92的全序列-837bp：

1   CAAAAAACGG CAAGTTGAAT TCAAGCTCGG TACCGTAATA CGACTCACTA TAGGGCGACA TATGATCGAT GATATCCCAT

81  GGGCGGCCGC CTGCAGACCA GGTCTCAGCT CACGACAGAG CGGGGAGACA TTGAGATGCC ATCGGTGTGG TCAGCCGGGG

161 CACATCAAAA GGAACTGTCC TCATGGTGGC AGTGGTGCAG GAGTGGCTAG GGGTTTTCAG CACGGACCCA GGCCAGCCAC

241 CGGGACGCAG GCAGATTTCA GACCTCCTCT TCCTTCTCAG ACAGAGGCTT ATGCTCAGAG ATTCCAGTCT GGGAAGGGTG

321 TGGCAGGGAC TTCAGGTCAG CAGACGGGTC CCAGGGGGGG GGTTCCCGGA GAGATCCGCC GCGCACATCC GCGCTTACAG

401 CTGTTCTTGC TGCGCTTGCG GAAGAGGGAG AGGCTTCCAC CGACCCTTCA ATGATCGGGG GTAGGATTGC CTTTGTCACC

481 GTTTTTGCTG ATGCGGTAGT TGCATTGGGA GCCACCGTGC CATACATTGC GAACGATTTT GGAACAGCTT TGACGGTGCT

561 GATTATGCCG ATCGATGTGC CCCCCTCTTG TGAGCATTCC TATGGGCGTG CATGTGGGCC TGGACAGAAG GATGCCACAT

641 ACTGTGGAAA TGACCATTCT CATATGCAAG CTGATATGTG ATTACGTGGG GATCGACAAG GCGAGTCCTG ATATGGAATT

721 TCGTGACGCA TTGGTTGGCC ACATTTGAGG GCTCTCTTGA TTCGATCTGG GTGAAGGGTC AGTAAGAAGA ACAAGATAGA

801 TACGGAAAAT GTTTGTGGGG AGAACACCCC GGACATC；

D、根据RAPD片段ST37、ST43、ST92的DNA序列，设计得到10条5对DNA片段，即：

P1/P2：5′CTTGTCTGTGGATGGT 3′/5′GTGTGGATTTTATTGG 3′；

P3/P4：5′TAGCCCGAGGTGTTCT 3′/5′TCTTGTTCCCGTTGTT 3′；

P5/P6：5′TCGGTGTGTTGAGTATTGGC 3′/5′TCGTTGTTTTTTATGCTGGT 3′；

P7/P8：5′TGTGGCAGGGACTTCA 3′/5′GCATCAGCAAAAACGG 3′；

P9/P10：5′CGACAAGTGGTGGTTGAGACG3′/5′CACGCACGACAGGACGCT3′。