[发明专利]水稻叶片衰老特异性启动子的鉴定及应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程和水稻分子育种技术领域，具体涉及到一个叶片衰老特异诱导表达的水稻启动子的克隆及其在转基因水稻中的应用。

背景技术

水稻是人类最重要的粮食作物之一。虽然目前杂交稻的推广暂时解决了人类的粮食危机，但是目前生产上广泛使用的一些优良杂交稻组合存在着一个重要的缺陷：生育后期叶片易早衰，导致光合能力降低，库大源不足，造成结实率低、充实度不良的问题。叶片是植物进行光合作用，吸收水和CO₂产生能量的重要场所，也是植物体合成氨基酸、抗氧化剂、各种营养物质的工厂。一只叶片衰老，其光合能力将显著下降，因而作物的产量很大程度上受到叶片衰老的影响。如果在生殖生长中后期，叶片能够保持较长时间的健康持绿状态，能尽量持久地保持光合能力，并且增强它在籽粒充实期间的营养物质输出能力，改善籽粒充实度，提高产量有重要的意义。

植物自身细胞核基因如何调控衰老进程，其中的分子机制尚不明确。传统的方法往叶片上喷洒激素如细胞分裂素，或是在作物结实期适当追加氮肥，都可一定程度的延缓衰老。随着生物技术的发展，在培育持绿性水稻的策略中，采用分子遗传调控的手段来延缓叶片衰老是一条经济有效且保护环境的措施。这主要是基于激素生理学，运用转基因手段，增强细胞分裂素在植物体内表达来延缓衰老。细胞分裂素是植物衰老调节研究最多的一种天然激素。细胞分裂素调控植物细胞分裂和分化，控制植物生长发育的多种进程，茎和芽的生长、营养信号的传导、增加作物产量等。细胞分裂素能够抑制核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、蛋白酶等的活性，能延缓核酸、蛋白质、叶绿体等的降解并且促使营养物质向应用部位移动。异戊二烯合成酶基因IPT编码调节细胞分裂素合成的关键限速酶，利用从根癌农杆菌中分离的IPT基因，人们在叶片抗衰老基因工程研究中开展了大量的工作，培育了一些持绿性植物(Smigocki，Cytokinin content and tissuedistribution in plants transformed by a reconstructed isopentenyl transferase gene.Plant Mol Biol，1991，16：105-115；Li等，Genome-wide transcription analyses in rice using tiling microarrays.Nat Genet，2006，38：124-129；Gan and Amasino，Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin.Science，1995，270：1966-1967；McKenzie，Controlled Cytokinin Production in Transgenic Tobacco Using a Copper-InduciblePromoter.Plant Physiol，1998，116：969-977；Lin等，Cultivating rice with delaying leaf-senescence by P_SAG12-iptgene transformation.Acta Bot Sin，2002，44：1333-1338；Chang等，Overproduction of Cytokinins in PetuniaFlowers Transformed with P_SAG12-IPT Delays CorollaSenescence and Decreases Sensitivity to Ethylene.PlantPhysiol，2003，132：2174-2183；Huynh等，Regulation of flooding tolerance of SAG12：ipt Arabidopsis plants bycytokinin.J Exp Bot，2005，56：1397-1407；Calderini等，Delay of leaf senescence in Medicago sativa transformedwith the ipt gene controlled by the senescence-specific promoter SAG12.Plant Cell Reports，2007，26：611-615)。在这些研究中，早期利用的是表达量比较高的组成型启动子，如CaMV35S启动子或玉米Ubiquitin启动子，结果显示组成型过量表达IPT的转基因植株均表现为细胞分裂素含量增加，叶片衰老延迟，同时植株的生长发育形态也发生了许多不正常的变化，如叶片变小、叶型变圆，顶端优势丧失，不能形成根或形成的根不能伸长等，后来利用热激启动子Phsp70和铜诱导型特异启动子，发现转基因植株的侧芽和叶片数都明显增多。直到利用拟南芥衰老特异基因SAG12的启动子表达IPT转化烟草，取得了比较理想的效果，转基因烟草叶片和花的衰老明显延迟，开花数提高60％，种子产量提高50％，生物学产量提高40％。转化拟南芥、矮牵牛等同样达到延缓衰老的效果，开花数目亦有所增加，并且抗涝、抗旱性有所增强。但是该体系在水稻这个禾本科植物中的应用受到物种差异的影响，只起到了持绿的效果，没有增加光合产物。找到一个水稻来源的启动子在特定时期特定组织中高效特异的表达细胞分裂素将对培育持绿性高产水稻具有重要作用和意义。