[发明专利]抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白VP28－CD及制备和用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因生物工程技术领域。更具体涉及一种重组融合蛋白VP28-CD亚单位疫苗，同时还涉及一种大肠杆菌基因工程菌株的制备方法，具体涉及构建和高效表达可溶对虾白斑综合症病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28和家蚕抗菌肽Cecropin D成熟肽(CD)融合蛋白的基因工程菌株；涉及酸水解位点天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)的插入；还涉及上述菌株所表达的一种双功能融合蛋白在对虾抗WSSV及抑杀其它病原微生物中的用途。

背景技术

20世纪80年代以来，世界沿海各国的对虾养殖业蓬勃发展，随着对虾养殖业的企业化生产，其病害也日益突出，特别是对虾病毒性传染病已成了阻碍这一产业发展的重要因素。我国是全球最大的对虾生产国之一，1993-1994年我国对虾病毒病暴发流行，年产量减少70％以上，给我国对虾养殖业造成数十亿元的经济损失(陈宪春.世界性虾病蔓延及我国虾病防治进展[J].中国饲料，1995，11：10-11.)。近年来的对虾白斑综合征病毒(WSSV)、黄头症病毒(YHV)和桃拉综合征病毒(TSV)等病毒性传染病在世界各地广泛流行，除给对虾养殖业带来严重经济损失之外，还对海洋资源的可持续发展造成巨大威胁。其中WSSV是迄今为止对对虾养殖业危害性最为严重的病原体之一。

WSSV于20世纪90年代初首发于台湾，至今已席卷世界各国的对虾养殖地区，造成了巨大的经济损失。1993年5～8月WSSV在我国大陆沿海从南到北的养殖场暴发，日本等亚洲国家的对虾养殖场也相继暴发了此病。目前，在亚洲已报道的该病毒的流行国家和地区包括朝鲜、泰国、韩国、印度尼西亚、越南、马来西亚、印度、斯里兰卡、孟加拉国、中国大陆沿海及台湾省等。1995年，美国德克萨斯州对虾养殖场出现白斑综合征病毒，并在西半球的其它地区相继暴发。至此，WSSV在世界范围内传播开来，每年给对虾养殖业造成几百亿元的经济损失，成为威胁对虾养殖业的主要疾病。1995年，国际兽疫局(OIE)、联合国粮农组织(FAO)以及亚太地区水产养殖发展网络中心(NACA)将其列为需要报告的水生动物病毒性疫病之一。

WSSV是一种有囊膜的环状双链DNA病毒，呈螺旋状，属于Nimaviridae科，Whispovirus属，是已知最大的动物DNA病毒。其病毒粒子直径约65～70nm，长约300nm，呈现卵圆形至短杆状，无包涵体，在末端有一尾状延伸，囊膜内包裹杆状的呈垂直螺旋带条纹的核衣壳。目前，普遍认为WSSV存在水平传播(经口感染或接触感染)及垂直传播(经卵传递给子代)两种传播途径。近年来，国内外一些学者大量投入WSSV分子水平的研究，鉴于其基因组序列与基因库中已知基因的同源性很低，国际病毒分类委员会已将WSSV确定为一种新的无脊椎动物病毒。Van等报道WSSV基因组为29 2967bp(AF369029)，其大部分基因功能都未知，目前被鉴定的结构蛋白基因至少有18个，其中已确定的囊膜蛋白有5个(VP28，VP26/P22，VP19，VP466及VP281)，而VP28是其主要结构蛋白之一，由ORF1所编码，其N端有一高度疏水的α螺旋跨膜区域，是位于病毒囊膜的主要抗原蛋白。已有研究证据表明，对虾免疫系统不仅存在非特异性免疫，而且对WSSV也存在一定的特异性免疫应答。尽管对WSSV感染引起的免疫反应分子机制研究甚少，但目前已有报道WSSV主要抗原蛋白可能在感染过程中的作用。Van等通过用WSSVVP28抗血清对斑节对虾(Penaeus monodon)的体内中和试验表明，囊膜蛋白VP28对机体具有免疫保护性，推测可能是由于VP28阻断了病毒与宿主细胞受体的结合，从而抑制病毒囊膜与细胞膜的融合；而Witteveldt等(Witteveldt J，Cifuentes C C，Vlak J M，et al.Protection of Penaeus monodon against White Spot Syndrome Virus by oral vaccination[J].JVirol，2004，78(4)：2057-2061.)实验显示VP28的免疫保护力可达3周，提示VP28可能在WSSV感染后还诱导产生类血清中和因子。龙燕等(龙燕，等。对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28的表达及其抗病毒感染作用[J]。中国病毒学，2006，21(2)：178-180.)将纯化的VP28注射和投喂螯虾均明显提高了螯虾的抗WSSV感染力的能力，这进一步证实了WSSV的结构蛋白可以被螯虾的免疫系统所识别。