[发明专利]一种基于抗生素筛选转基因水稻种子的方法

说明书

技术领域

本发明属于水稻转基因技术领域，更具体涉及一种基于抗生素筛选转基因种子的方法，尤其适合于水稻种子筛选。

技术背景：

目前水稻转基因种子筛选阳性植株，是用PCR的方法，进一步的鉴定是通过Southern blot。PCR的筛选方法其流程是：1，用水稻种子发苗待长到有6片叶大小时，大约要40天；2，剪取0.2克左右的叶片。用CTAB方法提取基因组；3，PCR验证；4，电泳检测。用这种方法筛选鉴定周期较长，因为要等到苗子长到一定大小才可以取材，因为并不知道这些苗子是阳性的还是阴性的，要栽种很多的苗子，所以要耗费大量的精力，之后的提取DNA，PCR，电泳也是一系列繁琐的工作，费时，费力，成本高！

发明内容：

本发明的目的是在于提供了一种利用抗生素筛选转基因水稻种子的方法，方法简便，筛选结果准确，能获得外源目的基因高效表达的植株，效率高，成本低廉，节约了资源。

一种利用抗生素筛选转基因水稻种子及其基因型判定的方法，其步骤是：

1，利用抗生素筛选转基因水稻种子：

A)最佳筛选抗生素浓度确定：设定抗生素选择梯度(对于潮霉素：0，100，200，400，600，800，1000ul/l原始浓度2.5ug/ul；对于卡那霉素：0，100，200，400，600，800，1000mg/l)，将未转基因的受体种子在其中萌发，幼芽生长刚好完全被抑制的抗生素浓度即为最佳筛选抗生素浓度。

B)筛选条件：在2.5mm左右深的、适当浓度(根据A)确定的最适合浓度(浓度为卡那霉素400mg/l和潮霉素600ul/l)的抗生素溶液中铺垫两层大小适中的滤纸，在其上均匀铺撒所需数量的(种子密度小于1个/平方厘米)饱满的转基因水稻种子；阴性对照是未进行基因转化的受体种子，阳性表型对照为未加抗生素的受体种子。

C)培育条件：保持培养体系密闭，密闭空间要有一定的高度(6～10cm)的条件下26-30度暗培养5天。

D)结果判定：结果将出现三种情况的种子：①阳性表型：芽体正常，根生长旺盛，根长超过2cm；②阴性表型：芽体和根生长受到典型抑制，根长小于0.5cm；③萌发不正常的种子，没有发芽，或者芽体不正常，此种表型是种子本身发芽能力不好所致，与转基因阴性阳性没有关系。

2，转基因植株的基因型纯合杂合的判定方法

该判定方法是建立在第一步上，以抗生素为基础筛选转基因阳性种子的方法的基础上进行统计分析。

判断方法1：

A)设置对照：用未转基因的受体种子做一个加入抗生素的阴性对照和一个未加入抗生素的阳性对照。

B)按照《以抗生素为基础筛选转基因阳性种子的方法》所阐述的为基础，如果想判定某一转基因株系的基因型，只要在进行此株系的种子筛选时设置一个不加抗生素的对照即可简单的判断出来。

对照如表所示：