[发明专利]一种大麦黄矮病毒RNAi植物表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种大麦黄矮病毒RNAi植物表达载体及其应用，特别涉及来源于大麦黄矮病毒GAV株系复制酶基因序列的双链RNAi双T-DNA植物表达载体及其在抗禾谷类黄矮病基因工程中的应用。

背景技术

禾谷类黄矮病毒病是由大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus，BYDVs)引起、蚜虫介导，在小麦、大麦、燕麦和黑麦等多种作物上广为传播的一种毁灭性病毒病害[Miller WA，Rasochova L.Barley yellow dwarf viruses.Annu Rev Phytopathol，1997，35：167～190]。禾谷类黄矮病毒病的发病面积和危害程度呈逐年扩大和加重趋势，BYDV-GAV是当前我国流行的病毒株系[Liu Y，Sun B，Wang XF，Zheng CL and Zhou GH.Three digoxigenin-labeledcDNA probes for specific detection of the natural population of Barley yellow dwarfviruses in China by dot-blot hybridization.Virol Methods，2007，145(1)：22～29]。栽培品种中的抗黄矮病基因极少，迄今没有发现来自普通小麦的抗病基因，即使在大麦中唯一鉴定命名的抗、耐大麦黄矮病基因Yd2，其抗性水平还受遗传背景和栽培条件影响[BurnettPA，Comeau A and Qualset CO.Host plant tolerance or resistance for control of barleyyellow dwarf.In：Barley Yellow Dwarf：40Years of Progress(D’Arcy CJ and BurnettPA eds)，1995.321～343；钱幼亭，周广和，周希明.从麦类种质资源中筛选大麦黄矮病毒抗原.植物保护学报，1993，20(1)：71～75]，抗病资源短缺是抗黄矮病育种取得突破性进展的限制性瓶颈因子。

近年来，植物抗病毒基因工程研究进展较快[Duprep，Henry M，Posadas G，etal.Genetically Engineering wheat for barley yellow dwarf virus resistance.BarleyYellow Dwarf Disease：Recent Advances and Future Strategies.Henry M & Mc Nab Aeds.CIMMYT，Texceco，Mexico，2002.27～28；张增艳，辛志勇.抗黄矮病小麦生物技术育种研究进展.作物杂志，2005，5：19～22]，然而，转化病毒复制酶基因、外壳蛋白(CP)和运动蛋白基因正义链或负义链获得的转基因植株抗性水平不高，通常表现为延迟发病时间或减轻症状[McGrath PF，Vincent JR，Lei CH，Pawlowski WP，Torbert KA，Gu W，Kaeppler HF，Wan Y，Lemaux PG，Rines HR，Somers DA，Larkins BA and Lister RM.Coat protein-mediatedresistance to isolates of barley yellow dwarf in oats and barley.Eur J Plant Pathol.1997，103：695-710；成卓敏，吴茂森，夏光敏等.应用基因枪法获得抗大麦黄矮病毒转基因小麦.植物病理学报，2000，30(2)：16-121]。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是真核生物中普遍存在的由双链RNA(dsRNA)介导的同源mRNA降解现象[Zamore PD，Tuschl T，Sharp P and Bartel DP.RNAi：double stranded RNA directs the ATP-dependent cleavageof mRNA at 21-23nucleotide intervals.Cell，2000，101：25～33]。在细胞中，长的dsRNA被类似RNase的Dicer酶切割成21～26bp的小干扰RNA(siRNA)。siRNA与蛋白复合物结合后形成RNA诱导沉默复合物RISC，同时解链。有活性的RISC与同单链siRNA互补的转录物结合后导致特定mRNA的降解。RNAi是植物在长期进化过程中形成的一种抗病毒机制，病毒在植物细胞内繁殖产生的双链RNA诱导了植物固有的RNAi机制，然而在相对中性的自然界，天然的RNAi系统不能起到完全或较高水平地抵御某种病毒侵染的作用[Voinnet O.Review，RNA silencingasa plant immune system against viruses.Trends Gen，2001，17(8)：449～459]。转基因大麦和烟草的研究表明，根据病毒的某一序列构建可在植物细胞内表达产生双链RNA(如发卡RNA)的载体，强化植物体内天然的RNAi抗病毒机制，能够获得免疫水平的高抗转基因植物[Waterhouse PM，Graham MW and Wang MB.Virus resistance and gene silencing in plantscan be induced by simultaneous expression of sense and an tisense RNA.Proc Natl AcadSci，1998，95：13959～13964；Missiou A，Kalantidis K，Bouflal A，Tzortzakaki S，MartinTabler M，Tsagris M.Generation of transgenic potato plants highly resistant to PotatoVirus Y(PVY)through RNA silencing.Mol Breed，2004，14：185～197]。作为一种新的分子育种技术，RNAi已成功用于植物抗病性、籽粒品质性状的改良实践。