[发明专利]针刺式组织片玻璃化冷冻载体与冷冻卵巢组织的方法

说明书

技术领域

本发明属于玻璃化冷冻保存领域，特别涉及卵巢、肝脏等器官或组织的玻璃化冷冻 载体和冷冻方法。

背景技术

随着深低温保存技术的进步，冷冻技术已不局限于冷冻细胞、配子或胚胎。对组织 器官的冻存是冷冻技术的发展趋势。玻璃化冷冻法是近年提出的超快速冷冻方法，比程 序化冷冻耗时短，方便廉价，无冰晶损伤，研究认为更适合细胞成分不单一的组织或器 官冻存，但玻璃化冷冻存在的缺点是：所需冷冻保护剂浓度较高，导致细胞毒性增加， 限制了其在人体组织、器官保存中的应用。改善冷冻载体或方法来提高冷冻速率以降低 冷冻保护剂的浓度，是近年来学者对玻璃化冷冻研究探索的主要内容。

卵巢是女性重要的生殖和内分泌器官，其内含有多种不同特性的细胞成分，且卵母 细胞具有不可再生的特性，因此对于卵巢的冷冻保存较其它组织器官更具有难度和挑战 性。对一些经历了大剂量化放疗的恶性肿瘤存活者、自身免疫疾病的治疗和其他医源性 因素而发生卵巢早衰的患者，疾病治疗前取少量卵巢皮质组织进行冷冻保存，之后解冻 复苏移植，给患者恢复月经和生育带来希望，是目前生殖医学研究领域的热点和难点问 题。

在对哺乳动物卵巢组织玻璃化冷冻中，传统的玻璃化冷冻方法是采取冷冻管作为载 体(麦管或冷冻小管)，将卵巢组织切成片状或条状，采用高浓度的冷冻保护剂脱水后， 将组织连同保护剂一起吸入或放入冷冻管封闭后，再直接放入液氮中，该方法冷冻保护 剂体积较大，降温速率较慢，因此，近年来被直接与液氮接触的冷冻方法所取代。如对 小鼠和人卵巢组织的冷冻研究中，采用聚酯纤维薄膜或电镜铜网作为载体(见Hasegawa A，Hamada Y，Mehandjiev T and Koyama K(2004)In vitro growth and maturation as well as fertilization of mouse preantral oocytes from vitrified ovaries.Fertil Steril 81，824-830.； Isachenko E，Isachenko V，Rahimi G and Nawroth F(2003)Cryopreservation of human ovarian tissue by direct plunging into liquid nitrogen.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 108，186-193.)；同样原理，有研究采用尼龙网作为冷冻载体；或者将牛或小鼠卵巢组织 块放入冷冻管中，将不封口的冷冻管直接放在液氮中或将少量液氮直接覆盖于卵巢组织 来增加组织与液氮接触面积，以加快降温速率(见Bordes A，Lornage J，Demirci B，Franck M，Courbiere B，Guerin JF and Salle B(2005)Normal gestations and live births after orthotopic autograft of vitrified-warmed hemi-ovaries into ewes.Hum Reprod 20，2745- 2748.；Chen SU，Chien CL，Wu MY，Chen TH，Lai SM，Lin CW and Yang YS(2006) Novel direct cover vitrification for cryopreservation of ovarian tissues increases follicle viability and pregnancy capability in mice.Hum Reprod 21，2794-2800)；此外，也有研究 采用无载体的玻璃化冷冻(见Yeoman RR，Wolf DP and Lee DM(2005)Coculture of monkey ovarian tissue increases survival after vitrification and slow-rate freezing.Fertil Steril 83，1248-1254；Li YB，Zhou CQ，Yang GF，Wang Q and Dong Y(2007)Modified vitrification method for cryopreservation of human ovarian tissues.Chin Med J(Engl)120，110-114)。这些方法或者不能使组织充分接触液氮，或者组织表面的冷 冻保护剂残留会降低冷冻速率，特别是多样本同时进行冷冻时，会增加操作难度，难以 保证各样本以同样的条件脱水和冷冻。