[发明专利]一种农杆菌介导的菘蓝转基因方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种农杆菌介导的植物转基因方法，特别是涉及一种农杆菌介导的菘蓝转基因方法。

背景技术

十字花科(Cruciferae)植物菘蓝(Isatis indigotica Fort)是我国南北各地广泛种植的一种大宗中草药，其根和叶是常用中药板蓝根和大青叶的主要来源。板蓝根在临床上用途较广，除板蓝板注射液外，主要常与其它中药组成复方广泛用于治疗多种疾病如流感、腮腺炎、乙脑、肝炎，是公认的有较好抗病毒效果的中药之一，此外，还具有抗炎、免疫调节、抗菌、解热、缓痛等药理作用。

80年代开始利用根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(Agrobacterium)的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物，甚至是裸子植物而诱发植物产生毛状根。发根农杆菌中含有致使植物产生毛状根的Ri质粒，在Vir区基因产物协助下，Ri质粒中的T-DNA片段能转移进植物核基因组中，导致转化成功的植物产生大量的毛状根。毛状根具有生长速度快，不需要添加外源激素，并能提供大量可药用的次生代谢产物的特征。农杆菌Ri质粒上携带的生根基因不仅能使被感染植物部位产生大量的毛状根，而且由产生的毛状根还可以获得再生的转化植株，这些植株可表现出许多稳定遗传的表现变异，在植物品种的改良方面具有较广阔的应用前景。

目前已有农杆菌介导的植物转基因方法申请了专利，如申请号为200510037948.5的“一种杨树的农杆菌基因转化方法”等，这些方法目前存在如下问题：一是都包含有共培养步骤，因此转化步骤多，花费时间长，转化成本高；二是外植体除菌是通过在增殖培养基或/和筛选培养基中加入抗生素来实现的，因而只能去除与培养基相接触的表面上的细菌，其它未与培养基接触的表面上的细菌则不能去除，因此除菌效果不佳，存活率低；三是转化率较低。

本发明的目的是提供一种转化率高、转化成本低、除菌效果好的农杆菌介导的菘蓝转基因方法，该方法取消了共培养步骤。

为达到上述目的，本发明采用的解决方案包括如下步骤：

将农杆菌划线接种于YEB固体培养基上培养1～2天后，用牙签挑取生长好的单菌落于YEB液体培养基中震荡培养；

将菘蓝种子先用无菌水浸泡，再用消洗灵浸泡，然后用无菌水冲洗2～4次，再用1‰的升汞消毒，并在消毒后用无菌水冲洗2～4次，最后用无菌滤纸吸干水分，接种于MS固体培养基中，在光照条件下进行培养；

将上述获得的菘蓝无菌苗切成约1～2cm长的外植体，接种于MS固体培养基中预培养12～48小时，然后放入上述制得的农杆菌菌液中，在超声波的辅助下振荡浸泡，使外植体与农杆菌充分接触，取出外植体，用无菌滤纸吸干外植体表面多余的菌液，转入筛选培养基中诱导毛状根，当筛选培养基上出现农杆菌菌斑时，取出外植体先用无菌水冲洗2～4次，再用含有抗生素的脱菌水除菌，然后用无菌滤纸吸干水后，接入新配制的筛选培养基上继续诱导培养，直至产生毛状根；

将上述获得的毛状根接入液体增殖培养基中培养，产生大量的毛状根。

上述菘蓝种子先用无菌水浸泡2～6小时后，再用0.02％的消洗灵浸泡2～6min，1‰的升汞消毒1～2次，每次3～5min。

所采用的农杆菌为发根农杆菌ATCC15834或Ri1601，培养温度为25～30℃，所培养的农杆菌菌液OD₆₀₀＝0.3～0.8。

上述菘蓝外植体在农杆菌菌液中浸泡8～15min，其中用超声波辅助超声作用为1～3min。

上述筛选培养基是1/2MS+头孢噻肟钠200～500mg/L+琼脂6～8g/L+蔗糖15～25g/L，诱导毛状根的培养温度为25～30℃，光照强度为1500～2000Lx，每天光照8～16小时。

上述脱菌水为含200～500mg/L头孢噻肟钠的抗菌素水，用脱菌水除菌的时间为3～10min。

上述MS固体培养基为MS+琼脂6～8g/L+蔗糖20～30g/L，培养温度为25～28℃，光照强度为1500～2000Lx，每天光照8～16小时。

本方案中毛状根最好采用液体培养基进行增殖培养，所选择的液体增殖培养基为1/2MS+头孢噻肟钠200～500mg/L+蔗糖15～25g/L。

本发明具有如下效果：