[发明专利]CehA突变体蛋白、基因、重组载体及其用途和制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及CehA突变体蛋白、基因、重组载体及其用途 和制备方法。

背景技术

农药残留已成为突出的环境问题，越来越受到人们的关注，消除环境中残留农药 的研究也越来越受到重视。残留农药的去除方法主要有生物降解、物理降解、化学降 解等，其中生物降解是指通过生物(包括各种微生物、植物和动物)的作用将大分子分 解成小分子化合物的过程。生物降解因不带入二次污染、条件温和，而越来越受到重 视，已成为当前食品安全领域的研究热点。化学农药的生物降解主要是通过微生物、 降解酶、工程菌、植物来进行，其中降解酶往往比产生这类酶的微生物菌体更能忍受 异常环境条件，而且酶的降解效果远胜于微生物本身，尤其是在残留农药质量浓度低 的情况下。

氨基甲酸酯类农药的结构基于毒扁豆碱，骨架为氨基甲酸，属于酯类有机化合物， 酯键断裂后即失去毒性作用，常用的是N-甲酰氨基甲酸酯。它们是目前使用仅次于有 机磷农药的一类杀虫剂，常用的品种有呋喃丹、西维因、速灭威等。氨基甲酸酯类杀 虫剂的毒理机制是抑制乙酰胆碱酯酶活性，阻断正常神经传导，多数属中等神经毒， 这与有机磷类类似。但同有机磷类的机制又有所不同：1.它不需经代谢活化，可直接 与乙酰胆碱酯酶形成疏松复合体，抑制后者的活性。2.与乙酰胆碱酯酶可逆结合，形 成的复合物可迅速分解，故症状较轻，恢复较快。

现在随着氨基甲酸酯类的广泛使用，其残留问题也凸显了出来。但到目前为止，发 现的能水解氨基甲酸酯类农药的酶，要么分子量过大，不利于工业化的应用，要么活 性不够强。因此，寻找一种酶蛋白和方法，能有效地水解氨基甲酸酯类农药，显得愈 发重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是寻找一种能高效降解氨基甲酸酯类杀虫剂的酶蛋 白。

为解决上述问题，

一方面，本发明公开了一种CehA突变体蛋白，为如下(a)或(b)的蛋白：

(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的蛋白；

(b)至少与(a)中的氨基酸序列70％同源性且具有水解的氨基甲酸酯类杀虫剂或 毒素活性的蛋白，除了氨基酸序列如SEQ ID NO.7所述的蛋白。

其中所述CehA突变体蛋白与SEQ ID NO.1所述氨基酸序列具有至少75％的同源 性。更优选地，该CehA突变体蛋白与SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列具有至少85％ 的同源性。

在实施方案里，本发明(b)中所述CehA突变体蛋白优选自氨基酸序列如SEQID N0.2～6所述的蛋白，其中最优选氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述的蛋白。

本发明的发明思路为通过基因工程技术人为缩短CehA蛋白序列，从中获得较原始 CehA蛋白具有更高水解氨基甲酸酯类杀虫剂或毒素活性的突变体蛋白。在这一思路 下，本发明所保护范围包括但不局限于上述突变体蛋白。

一方面，本发明公开了一种多核苷酸分子，其特征在于该多核苷酸分子编码本发明 所述CehA突变体蛋白。

一方面，本发明公开了一种包含本发明所述多核苷酸分子的重组表达载体。

一方面，本发明公开了一种包含本发明所述重组表达载体的转化体。

在一实施方式中，所述转化体为大肠杆菌。

另一方面，本发明公开了一种本发明所述CehA突变体蛋白的制备方法，包括如下 步骤：

①CehA突变体蛋白表达载体的构建；

②CehA突变体蛋白转化体的制备；

③CehA突变体蛋白的表达；

④CehA突变体蛋白的纯化。

另一方面，本发明公开了一种降解氨基甲酸酯类杀虫剂或毒素的组合物，包括本 发明所述CehA突变体蛋白和一种或多种可接受的载体。

另一方面，本发明公开了本发明所述CehA突变体蛋白在去除或降低氨基甲酸酯类 杀虫剂或毒素的残留或污染方面的用途。

与现有的CehA蛋白比较，本发明所述的CehA突变体蛋白活性更高，能有效地水 解氨基甲酸酯类农药，并且分子量更小，更稳定，可开发为工业应用低成本和高质量 的酶制剂。这为解决氨基甲酸酯农药残留或污染提供了新的选择。

附图说明

图1.纯化后不同CehA突变体蛋自的电泳图。