[发明专利]人冠心病易感基因-脂蛋白a基因拷贝数变异检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因拷贝数的检测方法，尤其涉及一种与冠心病相关 的人脂蛋白a的基因拷贝数的检测方法，还涉及一种检测脂蛋白a的基因 拷贝数的试剂盒。

背景技术

随着后基因组时代的来临，在功能基因组学研究中，定量基因分析占 有非常重要的地位。实时荧光定量PCR技术的问世，为后基因组时代疾 病相关基因的研究提供了一个极好的技术平台。实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR)通过设计针对目的基因的特异性引物和 探针，优化反应体系和反应循环参数，可同时检测大量样本，节省实验时 间和反应成本，为基因定量检测和准确定量疾病相关基因的表达提供有效 的技术手段，实现对人类和动物疾病的早期诊断与基因分期、分型，以及 对人类肿瘤转移的早期发现及预后判断，在临床上有广阔的应用前景。

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号累积，实时监测整个PCR进程及连续分析扩增相关的荧光信号， 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR反应过程中产生 的DNA拷贝数呈指数方式增加，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不 再以指数方式生成模板，进入平台期。在PCR反应早期，产生的荧光水平 不能与背景明显地区别，而后，荧光的产生进入指数期、线性期和最终的 平台期。因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量， 并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检样本进行比较，在实时 荧光定量PCR反应的指数期，首先需设定一个荧光信号的循环阈值 (cycling threshold，CT)，即每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值 时所经历的循环数。以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底 信号，如果检测到的荧光信号达到设定的阈值时被认为是真正的信号，它 所经历的循环数即为CT值。研究表明：每个模板的CT值与该模板的起始 拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起 始拷贝数的标准品可做出标准曲线，因此只要获得未知样品的CT值，即 可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

在实时荧光定量PCR技术中，目前应用最普遍的荧光化学方法是水解 探针法(hydrolysis probes)。水解探针法是一种利用标记荧光染料的基 因特异寡核苷酸探针杂交扩增产物的检测方法。通常使用Taq聚合酶的5’ 核酸外切酶活性来水解与目的序列杂交的探针：在PCR扩增体系中，溶液 中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导 下，被扩增物沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq酶的5’ 外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)，裂解双 链DNA 5’端核苷酸，释放出单个寡核苷酸。基于Taq酶的这种活性，设 计合成了一个能与PCR产物杂交的探针。目前，应用最广泛的是Taqman探 针。Taqman探针是一段特异性的寡核苷酸，其5’端标记荧光发射基团， 也称报告基团(reporter R)，3’端标记淬灭基团(quencher Q)，其序列 与模板DNA中扩增序列的一段完全互补。常用的报告基团包括：FAM、VIC、 TET、JOE、HEX(R)、CY3、CY5，淬灭荧光基团为MGB、TAMRA和DABCYL(Q)。 当探针保持完整时，5’端荧光发射基团吸收能量后将能量转移给临近的 3’端淬灭基团，发生荧光共振能量转移，3’端淬灭基团抑制5’发射基 团的荧光发射，故检测不到该探针5’端荧光基团发出的荧光。在PCR的 退火期，探针与引物所扩增序列内的DNA模板发生特异性杂交。延伸期引 物在Taq酶作用下沿DNA模板延伸，当到达探针处，Taq酶发挥5’～3’ 核酸外切酶活性而发生置换切断探针，使报告荧光基团和淬灭基团分离， 淬灭基团的抑制作用消失，荧光发射基团脱离3’端淬灭基团的屏蔽，接 受光刺激发出荧光信号。这时荧光探测系统便会检测到光密度增加。模板 每复制一次，就有一个探针被切断，同时伴有一个荧光信号的释放。由于 理论上被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，且光密度 和被释放的荧光基团的数目也是正比关系，因此荧光信号的累积与PCR 产物完全同步。在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量， 可推断出模板最初的含量，对模板进行准确定量。由于模板较短时扩增效 率较高，故扩增长度一般以50bp～150bp为佳。