[发明专利]用于骨髓基质细胞培养的诱导溶液的配方及使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞培养液的浓度及使用方法，特别是公开一种用于骨髓基质细胞培养的诱导溶液的配方及使用方法。

背景技术

临床上由于各种原因造成的种植体周围骨缺损、骨量不足，影响种植修复效果，随着组织工程技术的发展成熟，组织工程化骨为我们提供了一条新的思路。利用骨组织工程技术，将生长因子作为重要激活物与种子细胞、支架材料，立体培养等联系在一起，成为构建骨组织再生修复必不可少的要素。

细胞生长调节因子(简称生长因子)是一类具有控制细胞生长和活性、具有促进或抑制细胞增殖、分化、迁移和基因的表达等生物效应的多肽类物质。其对细胞增殖、组织或器官的修复、再生具有重要的促进作用，甚至微克或皮克级的生长因子也能发挥明显的作用。

已有多项实验证实，成纤维细胞生长因子可促进骨髓基质细胞增殖。目前大部分学者认为，成纤维细胞生长因子是作用于骨髓基质细胞分化增殖的早期，应与其他多种因素联合或序贯使用，才能达到促进骨髓基质细胞分裂增殖，增加细胞数量，同时促进细胞向成骨细胞分化的目的。在生长因子中，成纤维细胞生长因子对骨髓基质细胞具有最强的促增殖作用。不仅能提高骨髓基质细胞的增殖速度和寿命，且能在增殖过程中保持其多分化潜能。

骨细胞的微环境存在着多种生长因子，骨组织代谢是通过细胞因子网络发挥调节作用，不同的因子作用于成骨的不同阶段，且相互可能有协同作用。在不同的浓度，生长因子可以表现出相反的作用，选择合适的浓度或比例成为探讨热点。重组人骨形成蛋白-2和成纤维细胞生长因子两种因子成为骨修复重建领域的研究方向之一，但骨形成蛋白-2/成纤维细胞生长因子最佳浓度和比例尚无定论。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过重组人骨形成蛋白-2和碱性成纤维细胞生长因子的最佳浓度有效促进骨髓基质细胞成骨的促进骨髓基质细胞成骨溶液的配方及使用方法。

本发明是这样实现的：一种用于骨髓基质细胞培养的诱导溶液的配方，包括在成骨条件基础培养液中加入的生长因子溶液，所述生长因子溶液包括：重组人骨形成蛋白-2溶液50～200ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子溶液25～50ng/ml，所述重组人骨形成蛋白-2溶液与碱性成纤维细胞生长因子溶液的最佳浓度比为1∶1～8∶1。

所述重组人骨形成蛋白-2与碱性成纤维细胞生长因子的最佳浓度比例优选1∶1～2∶1。

所述重组人骨形成蛋白-2溶液中含有浓度为0.1～1.0mg/ml的牛血清白蛋白溶液。

所述碱性成纤维细胞生长因子溶液中含有浓度为0.1～1.0mg/ml的三羟甲基氨基甲烷溶液。

所述成骨条件基础培养液包含DMEM基础培养液9～10mg/ml、抗生素20～40U/ml、体积比为溶液总量的10～20％的胎牛血清，所述成骨条件基础培养液的ph值为7.2～7.4。

所述抗生素为青霉素或链霉素。

一种如上所述用于骨髓基质细胞培养的诱导溶液的使用方法，包括如下步骤：

(1)将1～2ml骨髓基质细胞放入浓度为9～10mg/ml、体积为10～15ml的成骨条件基础培养液中培养并传代；

(2)将上述传代的骨髓基质细胞以1×10⁵～2×10⁵个/ml密度接种于培养板，加入浓度为9～10mg/ml、体积为10～15ml的成骨条件基础培养液培养24～48小时；

(3)加入重组人骨形成蛋白-2溶液50～100ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子溶液25～50ng/ml，置于37℃、5％CO₂、100％湿度环境中培养1～6天；所述加入的重组人骨形成蛋白-2溶液与碱性成纤维细胞生长因子溶液的最佳浓度比为：1∶1～8∶1；

(4)吸去培养液，用四甲基偶氮唑盐比色法测定细胞增殖水平。

上述步骤(3)中加入的重组人骨形成蛋白-2溶液与碱性成纤维细胞生长因子溶液的最佳浓度比优选：1∶1～2∶1。

所述重组人骨形成蛋白-2溶液的配置方法为：将牛血清白蛋白溶于去离子水，配制成浓度为0.1～1.0mg/ml的牛血清蛋白溶液，将装有重组人骨形成蛋白-2冻干粉的小瓶离心后，加入配好的牛血清白蛋白溶液，余量为水，最终溶液浓度为50～100ng/ml。

所述碱性成纤维细胞生长因子溶液的配置方法为：将三羟甲基氨基甲烷溶于去离子水，配制成PH8.5、浓度为0.1～1.0mg/ml的三羟甲基氨基甲烷溶液，将装有碱性成纤维细胞生长因子冻干粉的小瓶离心后，加入配好的三羟甲基氨基甲烷溶液，余量为水，最终溶液浓度为25～50ng/ml。