[发明专利]肝芽干细胞及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及肝芽干细胞，及其制备方法和用途。

背景技术

近年来干细胞生物学得到了迅猛的发展。所谓干细胞，是指那些处于分化过程之中，具有分裂增殖能力，可自我更新，有多向分化潜能，即能分化产生一种以上“专业”细胞的原始细胞。干细胞依其分化潜能的大小可分为：①胚胎干细胞，即具有分化为机体任何一种组织器官潜能的细胞，如囊胚内细胞团细胞。②成体干细胞，即具有自我更新能力，但通常只能分化为相应(或相邻)组织器官组成的“专业”细胞，它是存在于成熟个体各种组织器官中的干细胞，如造血干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、角膜干细胞、胰腺干细胞、皮肤干细胞、肝脏干细胞等。在成体干细胞向终末成熟细胞分化的进程中，其分化潜能进一步限定，从而产生相应的祖细胞。

肝干/祖细胞的分离培养及其深入研究对于肝脏发育、肝脏肿瘤和肝脏再生的发生机理以及多种肝脏疾病的防治都具有十分重要的价值。一般意义上的肝干/祖细胞是指具有旺盛的增殖能力，并可以分化为成熟肝细胞和胆管上皮细胞的肝脏原始细胞。由于肝干细胞在肝脏中存在的数量极少，再加上其分离培养的技术条件又十分特别等因素的缘故，目前成功培养的肝干/祖细胞系是十分有限的。而在成功培养的这些肝干/祖细胞系中，它们则主要来自大鼠或小鼠。

对于人的肝干细胞的研究则相对少得多。目前仅见有来源于人成体肝脏(Herrera MB等，2006)，或晚期胚胎肝脏的干细胞(Dan YY等，2006；Malhi H等，2002)，而尚未见有来源于早期胚胎肝脏的干细胞。肝原基于人胚发育的第4周开始出现，第6周肝脏开始造血。大概90％的成体肝脏结构在胚胎发育的第8周可见。如果能从早期人胚肝芽组织中分离得到多潜能的干细胞，将为肝干细胞生物学的研究提供一个理想的细胞模型，也有可能为各种因素所致肝脏疾病的细胞治疗、药物的筛选、组织工程等多个领域的研究提供一种理想的细胞来源。

发明内容

本发明的目的是提供一种从人早期胚胎肝芽组织中分离培养多潜能干细胞的方法，本发明的另一目的是提供根据上述方法制得的肝芽干细胞及其应用。

本发明的一种从人胚肝芽组织中分离培养肝芽干细胞的方法，由以下步骤组成的：

A、原代培养物的建立：

取胎龄4.5至6周的流产人胚胎，以PBS充分洗涤后在解剖显微镜下分离出完整的胚胎肝脏，置于96孔板内以0.05％ Trypsin/EDTA消化约5分钟，然后加入改良IF培养液终止消化，静置后取悬液，置于铺有0.2％明胶的培养皿内，37℃、5％ CO₂、95％湿度条件培养；待3-4小时细胞贴壁后换液，以后隔天换液，每次均以PBS洗涤2-3次；

改良IF培养液是以IMDM培养基：HAM F12培养基＝1：1为基础培养基，添加2.5％胎牛血清、5μg/ml胰岛素、20ng/ml表皮细胞生长因子、1％非必需氨基酸、1mM GlutamaxTM和1％青/链霉素配制而成；

B、细胞传代培养：

在原代培养物生长两周以后，一种小三角形细胞出现优势克隆样生长，以无菌细胞刮去除其他形态的细胞，PBS充分洗涤后，用0.05％ Trypsin/EDTA消化至大部分细胞形态变圆，加入含有胎牛血清的培养液终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液，计数后以1×10⁴/cm²的密度接种至另一铺有0.2％明胶的培养瓶/皿中继续培养；每4～5天传代一次；

C、培养细胞的冻存与复苏：

a)细胞的消化与冻存：细胞长至约90％汇合时，PBS充分洗涤，用0.05％Trypsin/EDTA消化，至大部分细胞形态变圆，加入含有胎牛血清的培养基终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液，1000r.p.m离心6分钟，弃去上清液，以10⁷个细胞/ml的比例加入冻存液，充分混匀后置于冻存管中密封，先置于4℃ 30-60分钟，后置于-70℃ 10-14小时，最后置于液氮罐中保存；

冻存液是以冻存原液和步骤A中配制的改良IF培养液各一份混匀而成，冻存原液是以改良IF培养液：胎牛血清：二甲亚砜＝3:1:1配制而成；

b)冻存细胞的复苏：将冻存管从液氮罐中取出，置于37℃水浴箱中解冻；1000r.p.m离心6分钟，弃去冻存液，置于铺有0.2％明胶的培养皿中，加入改良IF培养液，37℃、5％ CO2、95％湿度条件培养。