[发明专利]一种用于评估硝酸甘油类药物治疗心绞痛疗效的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种硝酸甘油类药物疗效评估的方法，通过检测分析个体的线粒体乙醛脱氢酶基因ALDH2是否存在Glu504Lys变异来评估用于治疗心绞痛个体的硝酸甘油类药物的有效性，属于药物检测技术领域。

背景技术

心绞痛(angina pectoris)是冠状动脉供血不足，心肌急剧的、暂时缺血与缺氧所引起的临床综合症。

硝酸甘油(Glyceryl trinitrate，GTN)作为治疗心绞痛的经典药物距今已有130多年的历史，舌下含服硝酸甘油起效快(药物直接入血，症状一般在5～10分钟内迅速缓解)，并且可以避免肝脏的首过效应(即肝脏降解大部分经胃肠吸收的药物)，是处理急性心绞痛的标准治疗方法。其药理机制是硝酸甘油经过代谢后产生1，2-二硝酸甘油，同时释放出有扩张血管活性的物质一氧化氮(NO)，一氧化氮通过增加细胞内环磷酸鸟苷(cGMP)的含量而松弛血管平滑肌，缓解心肌缺血，降低心脏前后负荷，从而缓解心绞痛症状。

乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)是参与乙醇代谢的关键酶，线粒体乙醛脱氢酶(ALDH2)是其家族中活性最强的同工酶之一，被认为是生理条件下氧化代谢乙醛的主要途径，ALDH2基因位于线粒体内，定位于12q24.2，全长43.4kb，含13个外显子，编码518个氨基酸的蛋白，其主要功能是在肝脏内将乙醇代谢产物乙醛进一步脱氢成为乙酸，进入外周组织的三羧酸循环，分解产生CO₂和水，该基因的缺陷或活性下降会导致大量饮酒后体内的乙醛无法被及时代谢，从而导致一系列得对肝脏、血管、中枢神经系统的损伤，近来研究发现，ALDH2在GTN的生物转化过程中起重要作用。Stamler等证实ALDH2是使GTN活化并释放一氧化氮的关键酶，该酶具有酯酶活性，能特异性代谢GTN产生1，2-二硝酸甘油、亚硝酸盐和一氧化氮，实现血管扩张，而Chen等的研究显示ALDH2的酯解反应是人体内硝酸甘油生物活化产生一氧化氮的主要途径，研究显示硝酸甘油介导的血管扩张是cGMP依赖的，并且在体内和体外均能够被ALDH2抑制剂阻滞，但是非cGMP依赖的血管扩张并不被影响，同时，线粒体乙醛脱氢酶途径完美地解释了硝酸甘油的抑制：即在受到抑制的组织中，该酶的活性明显下降甚至完全失活，这些研究提示，硝酸甘油耐受可能与线粒体乙醛脱氢酶功能缺失有关。

在ALDH2第12外显子存在一个G/A单核苷酸多态，直接导致了相应编码的多肽链上第504位的谷氨酸被赖氨酸替代(Glu504Lys)，变异的蛋白基本丧失了酶活性。这个单核苷酸多态在包括中国人群的亚洲人群中的等位基因频率最高，大约是30％，等位基因G的纯合子(标记为ADLH2*1/ALDH2*1)所编码的蛋白具有正常的酶活性，但是杂合子(标记为ALDH2*1/ALDH2*2)和等位基因A的纯合子(标记为ALDH2*2/ALDH2*2)所编码的蛋白酶活性异常。Yifeng Li等在舌下含服硝酸甘油治疗心绞痛临床疗效与个体线粒体乙醛脱氢酶基因型的关联分析研究中发现80个人中有59人对硝酸甘油有效(73.7％)，其中等位基因G纯合子的个体有效率(47人中有40人，85.1％)要比至少带有一个等位基因A的个体的有效率(33人中有19人，57.6％)高，比数比为4.21(99％可信区间，1.51～11.7)。结果显示舌下含服硝酸甘油治疗心绞痛与线粒体乙醛脱氢酶基因型显著相关(x²＝7.59，p＝0.006)，经过性别、年龄和疾病严重程度等因素校正之后仍然显著相关。

定点变异研究显示半胱氨酸是脱氢酶活性和酯酶活性都必需的亲核基团，谷氨酸是激活半胱氨酸的必要基团。变异型ALDH2第504位赖氨酸取代谷氨酸后，赖氨酸所带的正电荷不仅使NAD⁺和酶之间的相互作用减弱，而且降低了半胱氨酸的亲核性。NAD⁺和对硝基苯乙酸(p-nitrophenol acetate，ALDH2酯酶活性的底物)又共用一个结合位点，NAD⁺浓度升高以后能够竞争性抑制酯酶的活性。李一峰等发现在GTN药物代谢过程中杂合子和纯合子变异型ALDH2相较于野生型ALDH2而言，Km值升高，Vmax值显著降低，ALDH2Glu504酶的催化效率比Lys504高出10倍，提示这个Lys504多态能够影响ALDH2的酶活性，降低GTN的生物转化能力。