[发明专利]一种人重组角蛋白19抗原活性片段表达载体及其应用

说明书

一、技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体地说涉及一种人重组角蛋白19的抗原活性片 段表达载体，以及利用该重组载体进行抗原表达的方法。

二、技术背景

角蛋白是细胞体的中间丝，具有中心性高度保守的α-螺旋杆状区域以及高度变异 的氨基和羧基末端区域分布在周围。角蛋白的DNA序列研究表明，角蛋白多肽是基因 转录的产物，而不是蛋白水解片段。根据角蛋白相对分子质量及等电位点，用二维电泳 可将人类上皮细胞角蛋白分离出20个条带，分别命名为CK1-20，其pI值为5.2～7.8， 分子质量为40000～60000，这些角蛋白分两型：I型具有酸性等电点，分子质量从40 000～56500不等；II型具有中性或碱性等电点，分子质量从52000～67000不等。细胞 角蛋白是由I型和II型角蛋白组成的异聚合体。所有的细胞角蛋白都有一个共同的分子 结构，它是组成不同类型复合物和细丝的基本单位。这些角蛋白遍及人类上皮细胞，正 常人上皮组织主要表达CK5，6，8，14，15。

角蛋白19(CK19)的相对分子质量为40000，是一种酸性多肽，是最早在鳞癌细胞 中检测出来的分子量最小的角蛋白，CK19的cDNA序列由1349bp组成，包括一个 1200bp的开放阅读框，起始于33位核苷酸，起始密码子为ATG，终止于1233位核苷 酸。CK19的免疫组化研究表明，覆盖正常支气管树的单层上皮、肺泡表面及呼吸道上 皮来源的肿瘤均有CK19表达，但不同组织学类型的癌细胞其CK19的表达强度不同， 小细胞肺癌最弱、鳞癌最强、腺癌次之。

CYFRA21-1是角蛋白19的可溶性片段，由于可用两种单克隆抗体KS19-1和 BM19-21检测到，因而命名为CYFRA21-1。正常时CYFRA21-1以寡聚物形式存在， 含量极低。当分布有CK19的细胞恶变时，可释放CYFRA21-1进入血液循环。过去10 年中，大量的临床研究资料已充分证实，由KS19-1和BM19-21两株抗体针对定量检测 血清中CYFRA21-1而配对组成测定方法，使得CYFRA21-1成为非小细胞肺癌患者最 有价值的血清肿瘤标记物，对非小细胞肺癌的诊断、病情监视和疗效判断有较高的临床 应用价值。

在体外获得CK19抗原可以用作生产相应CK19抗体的免疫原或是体外诊断试剂盒 的标准品。目前市面上出售的CK19抗原多为进口，因采用天然提取的方法获得(如 Fitzgerald公司生产的来源于人源细胞株的CYFRA21-1)，故生产成本高，得率少，价 格昂贵。平均每mg价格约为3000-5000元。而少数一些公司也有利用基因重组的方式 在体外表达CK19抗原(如中资汉脉公司生产的编码CK191-401aa全长基因的CK19重 组蛋白)，但是因错配率高通过普通PCR的方法得到编码CK19的全长基因比较困难；而 且根据这段全长基因构建表达载体表达的重组蛋白抗原活性不高，达不到天然提取物的 水平，并且稳定性差。因此有必要提供一种生产成本低、抗原活性高、稳定性又好的基 因重组蛋白。

三、发明内容

为了克服以上角蛋白19抗原产品的不足，本发明提供一种人重组角蛋白19抗原的 活性片段表达载体及其制备方法，以及利用该表达载体制备该活性片段的方法。

本发明的目的是这么实现的：

构建一种人重组角蛋白19抗原活性片段表达载体，是克隆有序列表中核苷酸序列3 的大肠杆菌表达载体，所述序列表中核苷酸序列3包含在编码角蛋白19的cDNA全长 序列中，并且含有两个单抗BM19-21、KS19-1结合表位的编码序列；所述的大肠杆菌 表达载体为pTrc-CKS。

天然CK19的cDNA序列由1349bp组成，包括一个1200bp的开放阅读框。而 Cyfra21-1为角蛋白19(CK19)的可溶性片段，其序列包含在CK19cDNA全序列中。 Cyfra21-1结构含有亲水性的棒状体部和疏水性的头尾，抗体表位为氨基酸链 QLADVRADSERQNQ及KAALEDTLAETEARFKS，两个抗体表位分别对应单抗 BM19-21与单抗KS19-1。