[发明专利]利用枯草杆菌发酵生产D－核糖的方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及生物技术中利用发酵的方法合成所需要的化合物的技术领域，具体地说，是一种利用枯草杆菌(Bacillus subtilis)发酵生产D-核糖的方法。

【背景技术】

D-核糖是一种具有重要生理生化功能的五碳糖，广泛存在于动物、植物和微生物的细胞中，是生物体内遗传物质，如核糖核酸(RNA)、若干辅酶和维生素的组成部分。

D-核糖具有巨大的经济价值，被广泛地应用于食品、医疗和制药领域：①可用于生产饲料添加剂和食品调味品；②是合成维生素B₂的重要原料；③可在临床上用于治疗心肌缺血、糖尿病、肌肉疼痛等病症；④被用于生产抗病毒和抗癌的药物等等。随着行业的发展和应用研究的深入，D-核糖将在食品和医疗行业发挥越来越重要的作用。

D-核糖的生产方法主要有三种：水解法、化学合成法和微生物发酵法。

(1)水解法。它是从酵母细胞中提取核糖核酸(RNA)，然后水解得到D-核糖的一种方法。这种方法的成本高、收率低，不适宜工业化大规模生产。

(2)化学合成法。是通过化学转化，将D-阿拉伯糖、D-葡萄糖酸、D-木糖、L-谷氨酸、D-葡萄糖转化成D-核糖的一种方法。采用汞电极电解还原核糖酸-γ-内脂生产D-核糖，可应用于工业化的大规模生产，当原料浓度为180g/L时，D-核糖浓度可达到90～120g/L。但是，这种方法由于使用汞电极，容易造成环境的污染，在人类重视保护生存环境、注重社会可持续发展的今天，它已属被淘汰的技术。

(3)微生物发酵法。通常是以葡萄糖为碳源，利用转酮醇酶缺陷菌株发酵生产D-核糖的一种方法，它成本低、污染小、适合于工业化大规模生产的要求。目前，对利用微生物发酵生产D-核糖已有诸多报道，研究过的碳源种类包括葡萄糖、果糖、木糖、甘露醇、山梨醇、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘油、乙酸、乙醇、葡萄糖酸等等，研究过的氮源包括酵母膏、蛋白胨、酪蛋白、尿素、氨基酸、玉米浆等；其中，以葡萄糖为碳源，以玉米浆为氮源的培养基应用的最为广泛。例如：如Kishimoto等人利用转酮酶缺陷型短小芽孢杆菌(B.pumilis ATCC 21951)，以200g/l葡萄糖、26g/l玉米浆为培养基进行发酵，得到92.0g/l的D-核糖，得率为0.552mol/mol〔见日本专利(JP)4,904,587〕。

又如：邓崇亮等人选育得到莽草酸和次黄嘌呤双营养缺陷型B.subtilisNo.271，以209g/l初糖为培养基进行发酵，获得96.4g/l的D-核糖，得率达到0.553mol/mol(见微生物学通报24：214-217，1997)。

再如：De Wulf利用转酮醇酶缺陷的枯草芽孢杆菌ATCC 21951，以100g/l葡萄糖和50g/l葡萄糖酸为混合碳源进行发酵，得到45g/l的D-核糖，得率为0.37mol/mol(J.Appl.Microbiol.83：25-30，1997)；以100g/l葡萄糖和100g/l木糖为混合碳源进行发酵时，得到60g/l D-核糖(J.Ind.Micro-biol.17：104-109，1996)。

尽管人们多年来对利用微生物发酵生产D-核糖进行了大量的研究，但是，目前使用的方法依然存在着发酵周期长、得率低的缺点。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌发酵生产D-核糖的方法，使D-核糖的得率有明显的提高。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产D-核糖的方法，其具体的步骤为：

(1)菌株的选择，选用转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌为菌株；

(2)菌种培养，将转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌菌株接入种子培养基活化，得到种子液；

(3)配制发酵培养基，以葡萄糖为碳源并添加有机酸；

(4)将步骤(2)获得的种子液接入步骤(3)配制的发酵培养基进行发酵。

步骤(3)所说的有机酸为短链有机酸。

所说的短链有机酸包括柠檬酸、乳酸或其可溶性盐。

柠檬酸的添加浓度为0.2～0.55g/l。

乳酸的添加浓度为3～7g/l。

本发明利用枯草杆菌发酵生产D-核糖的方法的积极效果是：

(1)选用转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌为菌株，在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中添加了有机酸，使D-核糖的产量增加达29.2％，得率增加达34.8％。