[发明专利]神经元性组织工程化周围神经的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物组织工程技术领域，具体涉及一种新型的修复长距离周围神经缺损的神经元性组织工程化周围神经的制备方法。

背景技术

周围神经再生的基本生物学特性为：周围神经损伤后，远端神经发生瓦勒变性，近端轴突发出的轴芽在间充质细胞的间隙向前滑行，长到远端的Büngner带中，并向靶器官生长形成突触连接；施万细胞使轴突髓鞘化；恢复神经结构，完成神经再生的过程。

目前，国内外多以雪旺细胞(Schwann cell，SC)、神经干细胞(neuralstem cell，NSC)、骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)为种子，体外或在体诱导分化为SC，构建组织工程化周围神经神经。这种组织工程化神经为损伤神经的再生提供通道和促进再生的因子，恢复神经的结构，但其桥接距离一般不超过30mm，不能满足临床上长段神经缺损修复的需求。轴突再生需跨越两个吻合口，增加了神经再生的难度；另外，轴突外生及在生长过程中的误入，易出现效应器的废用性萎缩或神经-效应器失配。这些问题目前难以解决。

本申请人在2007年4月18日递交的专利申请号为200710039573.5，发明名称为“组织工程化周围神经移植体及其制备方法”的中国发明专利申请基础上进一步改进与完善。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能满足临床上长段神经缺损修复的需求，且神经再生后能较好恢复神经功能的以神经元为种子细胞的组织工程化周围神经的制备方法。

为克服目前组织工程神经存在的问题，本发明的组织工程化周围神经的制备方法，所选用的种子细胞是以毛囊神经嵴干细胞(NCSC)诱导分化的神经元样细胞和类施万细胞的混合细胞，且神经元样细胞和类施万细胞的比例是1∶1；所选用的支架是异种去细胞神经基膜管。

一种组织工程化周围神经的制备方法，它包括以下步骤：

A)毛囊神经嵴干细胞的获得、培养和鉴定；

B)毛囊神经嵴干细胞加入2000nmol/L维甲酸和500ng/mL音猥因子激动剂(Sonic hedgehog)，作用7天诱导分化成神经元样细胞；毛囊神经嵴干细胞加入125ng/ml内皮素-1(neuregulin-1)，作用7天诱导分化成类施万细胞；

免疫细胞化学鉴定诱导后的神经元样细胞呈Tubulin βIII阳性，类施万细胞呈S100阳性；

C)异种去细胞神经基膜管支架的制备；

优选的，采用1％溶血卵磷脂制备犬脱细胞神经支架，参见Dumont CE等，Transplantation，1997，63：1210-1215，冻干并Co60照射灭菌后，备用；

D)体外构建组织工程化周围神经：将步骤B诱导的神经元样细胞和类施万细胞悬液按1∶1混合，制备细胞悬液，细胞密度为1.5×10⁶/ml，用微量注射器抽取细胞悬液，将微量注射器沿纵轴伸入异种去细胞神经基膜管支架中，每隔5mm注射等体积的细胞悬液，构建组织工程化周围神经。

上述毛囊NCSC可以从成体SD大鼠触须垫毛囊隆突区获取毛囊神经嵴干细胞(NCSC)，参见Sieber-Blum等，Developmental Dynamics，2004，231：258-269.，采用贴块法于神经干细胞培养液中培养，传代获得毛囊NCSC，免疫荧光细胞化学检测毛囊NCSC呈Nestin阳性和Sox10阳性；毛囊NCSC也可来源于自身，取材时对个体损伤小，可实现自体移植，不涉及免疫排斥反应和伦理道德问题；此外毛囊NCSC还具有成体干细胞和胚胎干细胞的特性，具有自我更新能力，具备多分化潜能，可分化为神经元、胶质细胞、平滑肌细胞、黑素细胞等，在特定的培养条件下，神经细胞的分化率可达90％以上。

本发明制备得到组织工程化周围神经可避免再生轴突外生及生长过程的误入，缩短了再生神经纤维到达效应器的时间，避免了效应器的萎缩，不仅能满足临床上长段神经缺损修复的需求，而且神经再生后能较好恢复神经功能。

附图说明

图1是本发明制备的神经元性组织工程化周围神经的功能恢复评估结果

其中A：空支架组；B：组织工程化周围神经组；C本发明制备的神经元性组织工程化周围神经组

图2是采用HRP逆行示踪技术对移植体中细胞表达分子的检测结果

其中A：生理盐水组；B：HRP示踪组(箭头示TMB染色阳性细胞)；C：移植体中突触素的阳性表达(箭头示阳性细胞)