[发明专利]一种含羟基红花黄色素A的红花的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物科学技术领域，具体涉及一种含羟基红花黄色素A的红花的筛选方法

背景技术

红花Carthmus tinctorius L.为菊科植物红花的干燥管状花，临床应用广泛。主要化学成分有黄酮类、吲哚类、木脂素类、烷基二醇类等。黄酮类成分中的羟基红花黄色素A(Hydroxysafflor yellow A，简称HSYA)是红花主要的活性成分，具有具有抗心肌缺血、抑制血小板聚集、抗氧化等多种药理作用，近年来备受关注(施峰，刘焱文，红花的化学成分及药理研究进展，时珍国医国药。2006，17(9)：1666-1667)。因此，羟基红花黄色素A含量的高低，直接影响红花品质的优劣。对红花品质相关功能基因进行研究，对提高红花的产量和质量具有重要意义。目前传统的筛选含羟基红花黄色素A的红花品种的方法有高效液相方法(郭美丽，张芝玉，张汉明等，不同产地红花药材的质量评价，中国中药杂志，2000，25(8)：469-471)，但此方法需将红花药材成品晒干并用含水溶剂提取得到含羟基红花黄色素A的提取物后，再用纯度高的羟基红花黄色素A为对照品进行含量测定后才能检测到，而直接应用基因条带筛选可不需对照品，直接从新鲜红花材料中筛选含羟基红花黄色素A的品种。

cDNA-AFLP技术(cDNA amplified fragment length polymorphism)，是Bachem等将AFLP技术应用于mRNA表达差异分析的mRNA指纹图谱技术，广泛应用于植物生长发育过程基因分离与差异表达特性的研究。分群分类方法(BSA)，是由Michelmore等(Michelmore R W et al.Identification of markers to diseaseresistance genes by Bulked Segregant analysis.A rapid method to detectmarders in specific genomic regions by using segregating populations.Proc Natl Acad Sci USA，1991，88：9828-9832)首先提出的一种筛选分子标记的高效方法。即按照选择目标把单交组合产生的F2代、回交群体或者DH群体的个体分成两个混合群体，这样在两个群体之间除了目的性状以外，遗传背景是一致的，具有和近等基因系相似的遗传组成，是对近等基因系的原理的一种突破。通过对这两个群体进行cDNA-AFLP引物的筛选可以找到与目的基因相连锁的标记。cDNA-AFLP和BSA的结合可以大大地提高筛选的效率。

目前尚无应用cDNA-AFLP技术结合BSA法对含与不含羟基红花黄色素A红花进行差异表达分析。本发明的目的在于利用cDNA-AFLP技术，结合BSA法在红花中找到与羟基红花黄色素A紧密连锁的基因，继而提供一种筛选含羟基红花黄色素A的红花品种的方法。

发明内容

本发明目的是提供一种含羟基红花黄色素A的红花的筛选方法。

本发明应用cDNA-AFLP技术结合BSA法对含与不含羟基红花黄色素A红花进行差异表达分析，在红花中找到与羟基红花黄色素A紧密连锁的三条基因，该基因具有如SEQ ID NO：1-3所示的核苷酸序列。具体方法如下：

本发明以含羟基红花黄色素A红花品系No.16为母本，不含羟基红花黄色素A红花No.25为父本进行杂交，获得F1代种子，F1代种子进行自交加代获得的F2种子，继续种植，从单粒F2种子获得F2代群体共计266个单株。然后进行以下步骤：

1.根据F₂代群体的羟基红花黄色素A的含量有无，取等量含羟基红花黄色素A的F₂代个体的花冠混成有池，另取不含羟基红花黄色素A的F₂代个体的花冠混成无池；

2.提取红花总RNA，反转录成双链cDNA；

3.通过cDNA-AFLP对含有羟基红花黄色素A与不含羟基红花黄色素A的红花的差异表达分析，在E10M8和E9M3引物组合中获得TDF-8(E10M8)、TDF-9(E10M8)和TDF-27(E9M3)3条片段；

4.对3条片段进行回收，克隆和测序。TDF-8具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；TDF-9具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；TDF-27具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。