[发明专利]一种红外线辅助蛋白快速酶解方法

说明书

技术领域

本发明属蛋白质组学技术领域，具体涉及一种红外线辅助蛋白快速酶解方法。

背景技术

肽质量指纹图谱法(Peptide mass fringprint，PMF)是研究蛋白质结构信息和鉴定蛋白 质的常用方法。蛋白质的酶解是蛋白质组学研究中蛋白质分析的一个关键步骤，目的是将 蛋白分解成肽段，然后用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)或液相 色谱电喷雾质谱(LC-ESI-MS)分析多肽混合物，获得肽质量指纹图谱。由于传统的溶液 酶解方法耗时(12小时以上)，限制了蛋白质分析速度的提高，建立高效快速的新型蛋白 质酶解方法具有重要意义。

目前提高酶解效率的方法主要有固定化酶技术以及微波和超声波辅助酶解技术等。固 定化酶技术中研究较多的有酶微反应器和磁固定化酶技术。酶微反应器主要是将蛋白水解 酶(如胰蛋白酶)通过溶胶-凝胶包埋和共价键合等技术固定在毛细管或微流芯片的微通道 内表面，由于可将高浓度的蛋白水解酶固定在微小的通道内，可使酶解时间大幅缩短。而 磁固定化酶技术是将蛋白水解酶通过共价键合等手段固定在磁球表面，使固定有酶的磁球 与蛋白溶液反应生成多肽后，通过磁铁将磁球分离。该酶解技术需要外加热源，以促进酶 解。最近采用微波辅助溶液蛋白酶解已有报道，利用该技术酶解蛋白只需要十几分钟。此 外，超声波也被用于促进蛋白溶液酶解，酶解时间可缩短到数分钟。红外线是一种重要的 电磁波，其波长范围在750纳米到1000微米，在医疗、电器、化工等诸多领域获得广泛 应用。按其波长的不同，可分为近红外线(0.75-1.5微米)、中红外线(1.5-5.6微米)和 远红外线(波长5.6-1000微米)。然而采用红外线促进蛋白质酶解尚未见文献报道。一次 偶然的机会我们尝试用红外线灯泡代替水浴作为能量来源促进蛋白质酶解，意外的发现在 5分钟内蛋白已经完全酶解，于是开展了深入研究，并设计了红外线辅助蛋白快速酶解装 置。

本发明提出的红外线辅助蛋白酶解技术将蛋白质的酶解时间从传统溶液酶解的12小 时以上大幅度降低到5到10分钟，大大节约了酶解时间，提高了工作效率。由于该技术 仅用红外线代替传统蛋白溶液酶解技术中使用的水浴，设备简单，红外线对人体无害，操 作安全，可用于批量蛋白样品的高通量酶解和鉴定。本发明提出的红外线辅助蛋白快速酶 解技术及其装置在蛋白质研究、生物医学研究以及药品和食品分析等领域有良好的应用前 景。

发明内容

本发明的目的在于提出一种红外线辅助蛋白快速酶解方法。

由于红外线照射物体会产生热量，而蛋白水解酶(如胰蛋白酶)的最适宜温度为37℃， 且温度过高酶会失活。本发明首先设计了可控温的红外线辅助蛋白质酶解装置，其结构如 附图1所示。将红外线灯泡1(功率100-500W，红外线波长范围1.72到16.66微米)安 装在一有通气孔的箱子5中，在箱的侧壁安装风扇4，向箱内鼓入冷风以调节箱内温度。 风扇4的启动和关闭通过连有热电偶2的温度控制仪6控制，热电偶2置于箱中以探测其 中的温度。因红外线灯泡会产生热量，当箱中温度高于设定温度(如37℃)，温度控制仪 6将开启风扇，而当箱中温度低于设定温度，风扇将被关闭，从而构成可控温的红外线辅 助蛋白酶解装置。

将蛋白质溶解在10-100毫摩尔/升的缓冲液(如碳酸氢铵溶液)中，pH值为7.5-8.5， 蛋白质在缓冲液中的浓度一般在1-500纳克/微升，于90-100℃的水浴中加热变性5-15 分钟，使蛋白的酶切位点充分暴露。然后与蛋白水解酶溶液(如胰蛋白酶溶液)混合，其 中蛋白质与蛋白水解酶的质量比为1∶20-1∶100，该溶液密封于对红外线透明的容器(如 聚丙烯离心管等)中，也可以直接点在板上(如不锈钢质谱靶板)，然后于上述酶解装置 中进行红外线辅助酶解，酶解时间控制在5到10分钟，可使溶液中蛋白酶解完全。