[发明专利]一种双荧光蛋白分子细胞标记的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说，涉及一种双荧光蛋白分子细胞标记的方法。

背景技术

荧光显微技术为细胞生物学的研究提供了一个极为有用的工具，通过直观的图像，研究蛋白分子在细胞内的动态行为。如蛋白分子的分泌，内吞，运输，定位，蛋白质的出核与入核，细胞内蛋白分子的相互作用等。传统的方法是通过蛋白分子与标签蛋白(如GFP，YFP，Flag，HA.....)等融合表达，在细胞中通过GFP的自发荧光或者各种标签蛋白的相应抗体偶联的荧光分子受激发后所发出的各种不同波长的荧光而达到观察的目的。

但由于抗体的方法抗体不能自由进入或细胞因此不适合于做活细胞的标记，而GFP的方法虽然可以用于活细胞的标记，但是由于GFP融合的蛋白会在发射波长上不断的发射荧光，这对一些动态学的研究来说会有所影响，因此，很有必要提供一种新的标记方法，以克服上述传统方法中存在的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于，提供了一种双荧光蛋白分子重组质粒，以进行双荧光蛋白分子细胞标记。

本发明还有一个目的在于，提供了一种双荧光蛋白分子细胞标记的方法。

本发明提供的用于双荧光蛋白分子标记法方法的重组质粒，包含：1)编码多肽A(即标签蛋白A)的DNA片段A，该标签蛋白可以特异地与其荧光底物共价的结合，其5’端或3’端可融合一段编码待检测蛋白C的DNA序列C；2)编码多肽B(即标签蛋白B)的DNA片段B，该标签蛋白可以特异地与其荧光底物共价的结合，其5’端或3’端可融合一段编码待检测蛋白D的DNA序列D；3)片段A-C与B-D之间是由一段内部核糖体插入位点元件的双顺反子ORF表达系统序列(IRES)DNA序列E连接在一起；4)在片段AC的上游的合适位置的一段负责DNA片段AC、E和BD的转录控制的DNA元件(即启动子)。

根据本发明的一个优选实施例，所述标签蛋白包括SNAP、Halo。

本发明提供的双荧光蛋白分子细胞标记的方法，包括以下步骤：构建用于双荧光蛋白分子标记法方法的重组质粒、细胞转染和荧光标记。

根据本发明的一个优选实施例，使用本发明提供的标记方法可在细胞的任一时像，例如有丝分裂期进行标记。

使用本发明提供的重组质粒，可在同一个载体中协同共表达两个目的基因，无需担心共转染的效率及其它共转染过程中可能产生的问题，能很好的同时标记同一细胞中的两个不同蛋白，利用各自的底物带上不同的荧光，在同一视野下能同时观察两种蛋白分子在细胞中的定位，两种标记方法相互之间不会有所干扰，可同时进行标记，不会影响标记的特异性，不会影响蛋白分子的正确定位；而且，标记过程简单，快速，能在15-30分钟内完成标记，比传统的抗体荧光标记方法大大节省了标记的时间，同时，其标记方法可在细胞的任一时像进行标记，因此可以观测细胞在不同时像的目标蛋白的情况。

附图说明

图1A是用于双荧光蛋白分子标记方法的重组质粒示意图。

图1B是实例pTOM20-SNAP-IRES-LEF1-Halo重组质粒示意图。

图2是内部核糖体插入位点(IRES)双顺反子ORF表达系统示意图。

图3是电泳检测结果图，其中图3A为扩增LEF1片段的PCR产物电泳结果，图3B为扩增SNAP Tag片段的PCR产物电泳结果，图3C为扩增TOM20片段的PCR产物电泳结果。

图4是双色荧光的共标记检测结果，其中，4A和4B分别为TOM20-SNAP(SNAP-cellTMR-Star)和LEF1-Halo(diAcFAM Ligand)的定位结果，4C为TOM20-SNAP(SNAP-cell TMR-Star)和LEF1-Halo(diAcFAM Ligand)的共定位结果。

图5是双色荧光的共标记检测结果，其中，5A和5B分别为TOM20-SNAP0(SNAP-cellBG505)和LEF1-Halo(TMR Ligand)的定位结果，5C为TOM20-SNAP0(SNAP-cellBG505)和LEF1-Halo(TMR Ligand)的共定位结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。

实施例1、重组质粒的构建