[发明专利]一种等温双向生长的基因合成方法

说明书

技术领域：

本发明涉及基因工程的技术领域，具体地说是一种等温双向生长的基因合成方法。

背景技术：

随着生物技术及医学的发展，设计或改造基因正得到越来越多的关注。传统的基因扩增、克隆、重组和突变技术只能得到自然界已有或类似的DNA序列，要实现对基因的自由设计，必须对基因进行人工合成。基因的人工合成包括两个步骤：一是用酶法将化学合成的寡核苷酸链进行人工拼接，得到较长的序列；二是以较长序列为基础，进一步拼接得到更长的DNA序列，直至达到需要的长度。对于较短的DNA序列(＜1kb)来说，一般无需步骤二。在基因人工合成中，步骤一是合成的关键步骤。目前主要有两种方法可以实现步骤一，分别是连接酶法和PCR法。

基因人工合成最初使用的是连接酶法(Khorana HG.Science.V203，614-625.1979)。在连接酶法中，引物序列之间存在互补的部分，可以相互杂交形成存在缺刻(nick)的长序列，这些缺刻可以在连接酶(T4 DNA ligase，Taq ligase等)的作用下被去除，从而得到连续的长DNA序列。由于所有的连接酶都需要5’磷酸化的末端和3’羟基进行连接，所以在反应之前，用于连接的中间引物需要进行5’磷酸化处理，这就使得基因合成的成本大大增加。同时，为了保证合成的效率，单次连接酶反应合成较长序列的长度受到限制，通常不宜超过500bp.

基因人工合成的PCR法，又称PCA(Polymerase Cycling Assembly)法，1990年被Dillon等人首次用于合成一段303bp的HIV-2rev基因(Dillon，P.J.&Rosen，C.A.(1990)BioTechniques 9，298-300.)，随后逐渐被推广应用。在引物设计方面，PCR法类似于连接酶法，引物之间需要一定程度的互补，互补的两条引物可以互为引物互为模板，经聚合酶的延伸，得到稍长的双链DNA，这些稍长的DNA之间也存在互补，从而可以继续延伸，这种过程在不同水平重复多次之后，便可以得到完整的双链。PCR法不需要对短序列进行任何修饰，因此合成成本较连接酶法大大降低。但由于是多种短序列间的并行反应，要合成的序列越长，则发生错误延伸的可能性就越大。一般来说，当序列大于500bp时，合成将变得难以进行。

PCR法通常还被用于更长序列的合成，如Smith等人(Hamilton O.Smith，Clyde A.Hutchison III，Cynthia Pfannkoch et al.PNAS.V100，15440-15445.2003)用Taq ligase对引物进行连接之后，再对连接产物进行PCR法合成，得到了全长的5,386bp的ΦX174 bacteriophage基因组。

经对现有技术文献检索发现，基因合成技术方面的专利大都涉及连接酶法的合成，例如US Patent 6,110,668描述了一种依赖于模板的基因合成方法，在这个方法中，合成的寡核苷酸可以杂交到模板上，而又与模板之间存在一些不匹配位点，用连接酶将这些寡核苷酸连接后，就可以得到一条与模板相似而又引入目标突变的序列。这一方法不能用于合成任意的序列，而且首先需要得到相似的模板，因而应用上很受限制。US Patent 6,521,427介绍了一种逐步连接的方法，在这个方法中，合成用的短寡核苷酸链逐个加入并杂交连接，或进行分组连接，组内连接之后进行组间连接；US Patent 6,670,127介绍了一种基于连接酶的类似方法。这些方法的优点是可以降低引物之间的错误杂交，缺点是操作复杂，而且也不能省去序列5’磷酸化的必要修饰，成本昂贵。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种改进的等温双向生长的基因合成方法，它可克服现有技术中操作复杂、成本昂贵、合成周期较长的一些不足。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种等温双向生长的基因合成方法，其特征在于：所述的基因合成方法具体包括以下步骤：

(1)、根据目标DNA序列设计并合成用于延伸的寡核苷酸链，或者纯化合成的寡核苷酸链；

(2)、将步骤(1)中所得的寡核苷酸链混合在反应体系中，并加入具有聚合酶、连接酶和限制性内切酶三种活性的混合酶，在多种酶的协同作用下进行等温双向生长并发生延伸反应，合成目标DNA长链