[发明专利]丹参3－羟基－3－甲基戊二酰辅酶A合成酶基因及其编码的蛋白质和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体说，是涉及在丹参中表达的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因及其编码的蛋白质和应用。

背景技术

丹参酮(tanshinone)是一种从中国传统的中药材丹参中分离得到的一类活性物质，主要由脂溶性的丹参酮I、丹参酮IIA、二氢丹参酮、隐丹参酮等丹参酮类组成。医学临床大量应用总丹参酮治疗金黄色葡萄球菌及其耐药菌株、链球菌等引起的化脓性扁桃腺炎、乳腺炎、蜂窝组织炎、骨髓炎、外耳道炎症及痈肿，外科感染等疗效显著。丹参酮广泛应用于临床医学，目前全球市场需求十分巨大。现代工业化生产中的丹参酮主要靠从丹参等天然植株中提取而获得。然而丹参酮的提取工艺繁琐，损耗量大，且丹参酮及其类似物在植物体内含量较低，所以从天然的丹参中提取丹参酮的方法远远不能满足人们对丹参酮日益增长的需要。因此，丹参酮药源的严重匮乏，已经成为制约丹参酮相关产业发展的最大障碍。

近年来植物基因工程技术的飞速发展和广泛应用，为利用现代生物技术提高丹参酮或其前体的含量开辟了一条崭新的途径。利用现代生物技术将丹参酮生物合成途径中的关键酶基因导入丹参中，获得转基因的细胞系、组织或再生植株，并进行大规模的培养，是实现从根本上提高丹参酮含量的最佳途径。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶是MVA途径中的一个重要的代谢酶，能够催化乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合生成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A，随后在HMG-CoA还原酶(HMGR)的作用下生成甲羟戊酸(MVA)，甲羟戊酸经焦磷酸化和脱羧作用形成C5的IPP，从而为丹参酮合成提供通用前体。通过提高3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶的活性或含量，可以间接的提高丹参中丹参酮或其前体的含量。

药用植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为唇形科多年生草本植物，主主产四川、山东、浙江等省。在我国民间常用于祛瘀止痛，活血通经，清心除烦。现代医学研究证明，丹参所含的活性成分具有扩张血管、降血脂、抗动脉粥样硬化、抑制血小板凝聚、保护心肌、抗菌消炎及抗肿瘤等作用。由于丹参作为重要的产丹参酮的草本植物，使其具有更多的研究优势如生长快周期短，易于遗传转化及植株再生等，这无疑为研究丹参酮的生物合成及其分子调控提供了更加快捷的来源与途径。

在对现有文献的分析中，“Scinece Asia(亚洲科学)2002，28：29-36”报道了从橡胶树中克隆了3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因，但至今尚未有从药物植物丹参中分离克隆出3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因的文献报道。由于这个基因编码的酶对于丹参酮的生物合成具有重要影响，因此，这一步是利用基因工程技术来调控丹参酮生物合成的重要切入点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因。

本发明第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。

本发明还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。

本发明的另一个目的在于提供该基因及其编码的蛋白质的应用。

本发明所提供的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因(DsHMGS)为以下核苷酸序列之一：

(1)具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

(2)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。

该基因所编码的蛋白质为丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶，是以下氨基酸序列之一：

(1)具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；

(2)SEQ ID No.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。

含有本发明的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因全序列或部分片段的重组载体，均属于本发明的保护范围。这些重组载体包括质粒和植物表达载体。

含有本发明的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因的宿主细胞，如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。

宿主细胞选自大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、烟草细胞、丹参细胞或丹参发根细胞。

优选的宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞或丹参发根细胞。