[发明专利]定量PCR检测体系及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种应用定量PCR方法对血液、血小板等无菌制品中细菌污染情况进行鉴定的检测体系及其制备方法。

背景技术

由血液、血小板制品细菌污染而引起的死亡已成为输血反应中的第二大致死因素，是危胁血液安全的一大隐患。目前主要应用全自动快速微生物培养检测系统进行鉴定。该系统的结果可靠，操作也相对简单。然而检测所需时间比较长。一般是培养24小时得到初步报告。而一些细菌如痤疮丙酸杆菌等通常要在100多小时后才可被检出。因而在短时间内还会有一些阳性的污染细菌未能被检测出来。很可能被输注到患者体内而引起严重的输血反应。

16s核糖体在细菌进化过程中变化缓慢，在细菌中存在着共同的保守区域，使之与真核生物、病毒等相区别。因此，将此保守区域作为鉴定细菌的靶点，应用定量PCR技术可以在几小时内检测出细菌污染情况。国外也有学者将这一技术引入到血小板制品细菌污染的检测中来。但是他们的检测体系并不能将少量菌与阴性对照有效地区别开来，造成假阴性。因此，需要一种快速、高灵敏度和高特异性的定量PCR检测体系，以适用于从血液、血小板制品中检测细菌污染情况。

发明内容

本发明的目的之一就在于提供一种新的减除细菌、核酸污染的定量PCR检测体系，该体系可方便细菌检测且灵敏度高，特异性强。

本发明的另一个目的是提供上述细菌检测体系的制备方法。

本发明的第三个目的是提供利用上述细菌检测体系的检测方法。

为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案是：

一种减除细菌、核酸污染的PCR检测体系，由下列组分组成：

引物、探针、dNTP、Mg²⁺、PCR反应液、DNA聚合酶和水。

上述减除细菌、核酸污染PCR检测体系的制备采取双过滤的方式减除细菌、核酸污染，包括下列步骤：

①取引物、探针、dNTP、Mg²⁺、PCR反应液加入水中混合，配成终浓度分别为引物150-400nM、探针150-400nM、dNTP 150-400nM、Mg²⁺1-10mM的混合物，然后用超滤膜过滤(12000-15000g，20℃，1-20min)。

②将DNA聚合酶加入步骤①得到的液体中，用微孔滤膜过滤(12000-15000g，20℃，1-20min)制得PCR检测体系。

本发明中，引物及探针为针对细菌16s保守区域(GENEBANK：AB280354)，该区域在细菌的进化过程中非常保守，为细菌的通用检测区，并且该段序列又是细菌所特有的，与真菌、病毒、细胞均无交叉反应。

本发明中，PCR反应液为市售的各公司生产的用于定量的PCR液。各生物公司均有出售。

本发明中双过滤时所采用的膜，一为超滤膜，优选截留蛋白质分子量为50-150KD，对蛋白质、DNA有一定吸附能力的膜，如YM-100；二为微孔滤膜，优选微孔直径为0.22um的可以截留细菌的膜，如Ultrafree-MC，超滤膜主要用于蛋白质的分离纯化，微孔滤膜主要用于过滤除菌。在本实验研究中发现将具备这两种膜引入到PCR反应液的制备中，超滤膜发挥了截留环境中及反应液中存在的细菌、核酸的作用，而微孔滤膜可以滤除DNA聚合酶中可能存在的细菌及其成份。因此，通过两次过滤方法，使得后续PCR反应后，所扩增得到的PCR产物，其模板是来自于所添加的模板中，可有效去除反应液中存在的核酸和细菌污染，避免了外源污染对检测的影响，可有效提高检测的特异性。

使用本发明的PCR检测体系，用以检测血液及血小板等无菌制品中的细菌，反应条件如下：

1.将模板加入PCR检测体系中。

2将配制好的PCR体系于50℃放置2min，再95℃放置10min

3.然后以95℃15s，60℃1min进行40个循环。

本发明的优点和有益效果：

在本发明中，利用细菌特点和核酸的性质。基于这些特点和性质创造了去除细菌、核酸污染的PCR检测体系，以检测血液及血小板制品中细菌污染情况。与其它细菌检测方法相比，本发明有几个明显的优点和有益效果。

1.检测的灵敏度高，检测细菌无种属限制，尤其有利于难培养细菌的检出；2.检测的特异性强，少量菌与无菌情况能够有效地区别开，避免了假阳性；3.污染菌和核酸的去除步骤简便，整个检测体系操作简单，3-4小时就可以得出结果，便于临床应用。

具体实施方式

实施例：

实施例1