[发明专利]一种缺失的霍乱弧菌封闭带毒素的表达方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种缺失的霍乱弧菌封闭带毒素的表达方法和应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

随着生物技术的日益发展，越来越多的具有生理活性的多肽或蛋白质分子被发现，多肽和蛋白类药物在现代疾病预防和治疗中作用日益突出。至今，美国已经开发生物多肽药物300多个。但是，由于多肽分子难以透过生物膜，加之体内外稳定性差、体内生物利用度低，一般只能注射给药。口服剂型易被患者接受，是多肽药物非注射剂型的主要发展方向。相对于注射给药，口服是一种方便并且病人依从性比较高的给药方式，对于需要长期给药的病人尤其方便。蛋白多肽类药物目前已有个别品种实现了口服给药，如口服干扰素、胸腺肽、脑蛋白水解物等。但是，由于药物本身的结构以及人体的吸收问题，蛋白多肽类药物口服生物利用度很低。通常情况下，蛋白多肽类药物分子量大，难以通过消化系统的生物膜屏障；胃酸、消化道酶等对蛋白多肽类药物有破坏、降解或聚合作用，严重影响其稳定性。因此，提高口服生物利用度是蛋白多肽类药物口服给药的关键。近年来，蛋白多肽类药物的口服给药技术研究不断取得新进展，为进一步发挥其功效提供了新的技术支撑。

霍乱弧菌封闭带毒素Zonula Occludens Toxin，简称ZOT，是美国科学家Fasano等1991年采用Ussing Chambers分析法测定CT阴性和CT阳性霍乱弧菌培养物上清液时发现的、由399个氨基酸组成的一种毒素。它通过影响细胞间紧密连接(tight junction，或称封闭带)，增加小肠粘膜的通透性。ZOT能可逆地调节紧密连接的结构，因而它能影响生物大分子物质的吸收。但是封闭带毒素为大分子，易形成包涵体，难以通过基因工程技术获得可溶性蛋白，为研究其生物学功能增加了难度。缺失的霍乱弧菌封闭带毒素(deletion Zonula OccludensToxin，cZOT)，是Marinarosaria等通过缺失ZOT基因不同区域，分析发现的封闭带毒素活性中心，是封闭带毒素的265～399位氨基酸片断，具有封闭带毒素的完整生物学功能，能够改变上皮细胞的通透性，促进蛋白、激素等大分子药物由黏膜吸收，增强可溶性蛋白的生物学活性，而且这一作用可逆、安全，不损伤组织，从而可能成为一种新颖、安全的多肽口服佐剂。由于其独特的生物学性质，使用cZOT有可能开辟一种新颖的生物大分子药物口服给药新途径，给制药工业及疫苗工业展示了光明的前景.

但是，cZOT有135个氨基酸，分子量大，目前技术条件下无法通过化学合成的方法获得；即使能够化学合成，其合成成本高，纯化困难。因此，需要一种高效廉价的基因工程制备cZOT的方法。同时，由于该基因稀有密码子含量较高(占30％)，而常规的大肠杆菌BL21(DE3)不提供稀有密码子的翻译，所以cZOT在BL21(DE3)中表达含量较低。因此，我们利用Rosetta gami(DE3)对稀有密码子的偏爱性，选择大肠杆菌Rosetta gami(DE3)进行诱导表达，以提高cZOT的表达量。

发明内容

本发明的目的是提供一种cZOT的高效表达方法，以期利用该方法大规模低成本地发酵生产cZOT。

本发明要解决的一个技术问题是提出一种高效表达cZOT的基因工程菌。该基因工程菌是携带重组质粒的大肠杆菌Rosetta gami(DE3)，所述重组质粒是含cZOT基因的质粒pET-32a(+)。具体分以下几个步骤：

1.构建含cZOT基因的大肠杆菌(E.coli)基因工程菌

将cZOT基因按照：SD序列-纯化标签His·Tag-硫氧还蛋白(Trx)-蛋白酶(肠激酶EK)酶切位点-cZOT基因-终止密码子(TAA)的碱基序列设计上游引物和下游引物，PCR得到该片断；用两种限制性内切酶Kpn I和EcoR I双酶切该片断，得到cZOT基因；用同样两种限制性内切酶双酶切质粒pET-32a(+)，纯化回收大片段，连接上述两种基因片段，得到重组质粒pET-32a(+)-cZOT；

2.构建高效表达cZOT的基因工程菌

将重组质粒pET-32a(+)-cZOT转化到大肠杆菌Rosetta gami(DE3)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素(100μg/ml)、卡那霉素(15μg/ml)、四环素(12.5μg/ml)、氯霉素(34μg/ml)中任意1-4种抗生素的LB固体培养基上培养16-20h，挑取阳性转化子，经测序验证，获得高效表达cZOT的基因工程菌；

3.制备获得TrxA-cZOT融合蛋白