[发明专利]基于磁珠和纳米金探针的微量蛋白质的测定方法

权利要求书

1、基于磁珠和纳米金探针的微量蛋白质的测定方法，其特征在于首先用待测蛋白质的单克隆抗体标记磁珠，在纳米金上标记上待测蛋白质的多克隆抗体，在纳米金上同时标记一种带有生物素标记的DNA探针，纳米金上的DNA探针通过生物素-链亲和素反应，又标记上了辣根过氧化酶，组成纳米金探针；将标记好待测蛋白质单克隆抗体的磁珠及纳米金探针与待测蛋白质样品混合，37℃温度下孵育，然后再洗去没有反应的纳米金探针，用四甲基联苯胺显色系统进行显色，从而达到对待测蛋白质进行定量测定的目的。

2、按权利要求1所述的基于磁珠和纳米金探针的微量蛋白质的测定方法，其特征在于测定步骤是：

A待测蛋白质的单克隆抗体标记磁珠

a)活化磁珠：选用羧基修饰的磁珠，用300-500μl 25mM pH6的MES溶液清洗300-500μl磁珠两次，加冰浴的50mg/ml碳二亚胺溶液40-60μl、50mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺溶液40-60μl，室温孵育30min；再用300μl25mM pH6的MES溶液洗两次；

b)标记磁珠：用60-100μl 25mM pH6的MES溶液溶解150-250μg的待测蛋白质的单克隆抗体，充分混匀，加入到已活化的抗体里，再加40μl 25mMpH6的MES溶液，使终体积为100-140μl；室温放置半小时或4℃放置2小时；再用300-500μl PBS洗4次，按所需浓度重悬磁珠，2-8℃储存备用。

B多克隆抗体及DNA探针标记纳米金

a)确定抗体的用量取100μl不同浓度的抗体加到1ml纳米金溶液里，室温静置5分钟，再向上述不同浓度的各管中加入100μl的1N NaCl溶液，室温静置1小时，稳定1ml纳米金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的用量；

b)抗体标记按照步骤a)确定的抗体用量，标记1ml纳米金，室温放置30分钟-1小时；

c)DNA探针标记向经过抗体标记的纳米金溶液里，加入巯基(5’端)及生物素标记(3’端)的DNA探针，使DNA探针的终浓度为3-5uM，室温静置标记，加入稳定剂稳定48-72小时，离心清洗3-4次，洗去未标记上的抗体及DNA探针；

d)HRP标记将2-3μl链亲和素-HRP与标记了抗体及DNA探针的纳米金溶液混合，在室温下放置1小时，用PH702的0.1M磷酸盐缓冲液PBS清洗3-4次，洗去未标记上的链亲和素-HRP，再加100μl10mM PB重悬，4℃保存备用；

C免疫反应

取标记好抗体的磁珠0.5-1μl，先与待测样品10-20μl在37℃下孵育30分钟-1小时，引入磁场，用洗液清洗3-4次，再加入1-2μl标记好的纳米金探针，继续杂交30分钟，杂交体积为20μl，杂交液为含0.05％Tween20及0.5％BSA组成的0.1MPBS，形成磁珠-待测蛋白-纳米金探针复合体，引入磁场，清洗4次，洗去未反应的纳米金探针；

D显色反应

向上述形成的磁珠-待测DNA-纳米金探针复合体中加入20-30μl HRP酶底物-TMB显色液，避光孵育10-15分钟，加入0.2M浓硫酸终止液10-15μl，90分钟内，450nm测OD值；

上述步骤B中a)内，不同浓度分别为0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml和5μg/ml；

上述步骤B中c)内稳定剂为含0.5-1％BSA、0.1NnaCl、10mN的PB溶液；

上述步骤C中的洗液为含体积百分数0.05％TWEEN20和质量百分数为0.1％BSA的PBS。

3、按权利要求2所述的基于磁珠和纳米金探针的微量蛋白质的测定方法，其特征在于选用羟基修饰的磁珠直径为1-3μm。

4、按权利要求2或3所述的基于磁珠和纳米金探针的微量蛋白质的测定方法，其特征在于选用羟基修饰的磁珠系Dynal公司生产的。

5、按权利要求2所述的基于磁珠和纳米金探针的微量蛋白质的测定方法，其特征在于步骤B中c)的室温静置标记17小时。