[发明专利]一种血清中氯霉素残留量的液相色谱-串联质谱测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种对生物体内氯霉素残留的测定方法，更具体是对人及动物血清中残留的微量氯霉素进行定量测定的方法。

背景技术

氯霉素是一种相对廉价且较有效的广谱抗生素，主要通过阻碍细菌70S核糖体与50S亚基的结合，干扰细菌蛋白质合成而产生抑菌作用。在其使用的50多年中曾有效的用于人类以及动物的多种感染性疾病的治疗，但是多年的临床应用表明，氯霉素对人类具有较大的毒副作用，其作用是结构中与羰基相连的一CHCl2基团引起的，它能使人体产生不可逆性骨髓造血功能障碍性疾病-再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症，还可以导致死亡率极高的“灰婴综合症”。

氯霉素的口服剂，针剂等药品已经在临床上很少使用，近乎消失。由于氯霉素的化学性质极为稳定，在曾经用药的食用性动物组织中很容易产生药物残留。世界许多国家都禁止在食用性动物饲养和治疗中使用氯霉素，即食用性动物组织和动物源食品中CAP的残留量为不得检出。虽然我国早已禁止CAP做为兽药使用，但是由于CAP对水产动物病原菌的抑菌作用强、价格便宜，20世纪80～90年代曾广泛地应于水产、畜牧、禽类等养殖中各种细菌病的预防与治疗上。由于各地对CAP的危害认识不一和药物使用惯性等原因，确实存在养殖户滥用抗生素的情况。有资料显示近几年各地分别有氯霉素检出的阳性报道，所以食源性氯霉素蓄积引发血液病逐渐得到认识。

再生障碍性贫血及粒细胞缺乏症是危害人民生活健康的一类常见血液病，而且近年发病率有不断增高趋势。所以对于此类血液病患者及有危险因素接触史的“亚健康”人群进行氯霉素微量残留的检测，对于疾病的预防和治疗都有重要意义。由于血清中小分子物质丰富，且氯霉素残留非常微量，所以血清中氯霉素的检测方法一直是难题。

血清中残留氯霉素的检测分别可采用微生物法、免疫法、放免法、GC、HPLC、GC-MS等分析方法，但方法检测的灵敏度大多难以满足取样量少、准确及高灵敏度的要求，近年来，随着色谱技术的飞速发展，对血清中氯霉素残留进行高灵敏度的定量分析成为可能。

现行的氯霉素残留的色谱-串连质谱检测中，或采用外标法定量，或用未经提取的氯霉素标样作为定量标准，影响检测结果的可靠性。同时，因其样品预处理采用多次液-液萃取、固相萃取或液-液萃取与固相萃取相结合的方法，其操作烦琐费，并易引入污染，而氯霉素的色谱分离又需要一定的时间，故难以满足实际工作尤其是大量分批检测分析的需要。

发明内容

本发明的目的是建立一种可快速、同时有效地对血清中氯霉素进行定量测定地切实可行地并具有通用性地方法，可较好地满足实际工作的需要。

本发明是这样实现的：

本发明建立的HPLC-MS方法以氘代氯霉素为内标，以内标法对血清中残留的氯霉素进行定量。与外标法相比，利用理化性质与氯霉素十分相似的氘代氯霉素为内标，可对包括样品预处理、色谱分离和质谱检测在内的样品分析全过程中所可能产生的各种误差进行校正。

本发明的定量工作曲线，系在空白血清中添加氯霉素标样后提取获得，可避免因提取回收率不同而产生的影响。在样品预处理中，采用简便的一次液-液萃取法对血清中氯霉素进行净化和富集，在样品的色谱分离中，采用细口径的色谱短柱和等度或梯度洗脱法实现氯霉素的快速色谱分离。

1.样品处理方法：

液-液萃取法：取适量血清入离心管，添加相当于待测血清体积0.1-5倍量的有机溶剂(甲醇、乙酸乙酯、乙酸甲酯、丙酮、乙腈、特丁基甲醚或乙醚)后漩涡混合提取，离心分离后，取上清液，经0.45μm滤膜过滤后待测，弃残渣。

2.HPLC-MS测定条件：

液相条件：流动相由乙腈(或甲醇)和含甲酸或乙酸(0.01～0.5％V/V)水溶液或醋酸铵(1-100mmol)的水溶液(用氨水调节PH＝6-9)组成，采用等度或梯度洗脱；乙腈：1-100mmol醋酸铵水溶液用氨水调节PH＝6-9，以体积比记为80-20％，20-80％。色谱柱硅胶键合相填料柱(C18、C8或氰基)的细径短柱(内径为1.0-3.0mm；长度为30-100mm)。

质谱条件：采用电喷雾离子源，负离子多反应监测扫描。离子选择通道为Q1/Q3 m/z分别为氯霉素：321/151或/和321/176或/和321/257；内标为氘代氯霉素：326/156或/和326/179或/和326/262。

3.标准工作曲线的制备和样品中氯霉素的定量