[发明专利]用于检测O型口蹄疫病毒的LAMP试剂盒及其建立方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测O型口蹄疫病毒的试剂盒及其建立方法和应用，特别涉及一种用于检测O型口蹄疫病毒的LAMP试剂盒及其建立方法和应用。

技术背景

口蹄疫病毒属于微核糖核酸病毒科B病毒属，是目前所知病毒中最细微的一级，其所导致的口蹄疫病被世界动物卫生组织列为A类动物传染病之首，其主要危害对象是猪、羊、牛等偶蹄动物，发病率可达100％，并能形成大范围的流行，危害严重，是进出境检疫和国家强制上报的必检项目。但是目前的检测手段一般是先现场采样，然后再送实验室检测，存在流程长、耗时多、成本高等弊端，既影响检测速度，更不利于疫病的及时控制与监测。

环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由T.Notomi(2000)发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列^[5]。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Masaki Imai等人(2007)利用LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；Nobuyuki Hayashi等人(2007)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以检测其他与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血病(VHS)、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、虹彩病毒，人类疱疹病毒8型、造血组织坏死病毒(IHHNV)、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒等。但尚未见有该方法在口蹄疫病毒检测中的应用。

发明内容

本发明的目的之一在于提供了一种用于检测O型口蹄疫病毒的LAMP试剂盒。

本发明的目的之二在于提供该试剂盒的建立方法。

本发明的目的之三在于提供该试剂盒的应用方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于检测O型口蹄疫病毒的LAMP试剂盒，其特征在于该试剂盒由包含有六条LAMP引物的LAMP反应液构成的检测体系；23μL LAMP反应液的具体配置为：

注：表中所列各成分浓度为母液浓度。

其中，六条LAMP引物为：

一种建立上述的用于检测O型口蹄疫病毒的LAMP试剂盒的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.从基因数据库检索获得所有O型口蹄疫病毒基因组序列，通过BLAST软件进行同源性分析，找到O型口蹄疫病毒基因的特异性的保守靶序列，该保守靶的DNA序列为：

CCT TGA GGC TAT CCT CTC CTT TGC ACG CCG TGG GAC CAT ACA GGA GAA GTT GAT

CTC CGT GGC AGG ACT CGC CGT CCA CTC TGG ACC AGA CGA GTA CCG GCG TCT CTT

TGA GCC TTT CCA AGG TCT CTT TGA GAT TCC AAG CTA CAG ATC ACT TTA CCT GCG

TTG GGT GAA CGC CGT GTG CGG TGA CGC ATA ATC CCT CAG

b.根据步骤a所得的保守靶的DNA序列，设计出上述的六条LAMP引物；

c.根据步骤b所得的六条LAMP引物配置出LAMP反应液，构成上述的检测体系。

一种应用上述的用于检测O型口蹄疫病毒的LAMP试剂盒来检测O型口蹄疫病毒的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：首先配置出23μL上述LAMP反应液，然后提取待测样品中的核酸，取2μL该核酸提取液加到上述已配制好的LAMP反应液中，使终反应体积为25μL，10000rpm瞬时离心30S以混匀反应液；最后放于65℃恒温1小时进行LAMP扩增；取出反应管，往反应液中添加5μL Picogreen(或SYBRgreen)，若反应液变成绿色，则说明待测样品中存在O型口蹄疫病毒，若为桔黄色，则待测样品中不存在O型口蹄疫病毒。

本发明具有下列优点：

1)高特异性：6条引物对靶序列8个特异区域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性，即LAMP能从相差仅一个核苷酸的基因标本中，找出相应得靶序列进行扩增，参见图1。

2)高灵敏度：LAMP灵敏度可与PCR相媲美或更高，其所需扩增模板可达10拷贝或更少，参见图2。