[发明专利]一种与人分子佐剂hC3d3同义突变体交联的疫苗读框

说明书

技术领域

本发明属生物制药领域，涉及一种与人分子佐剂hC3d3同义突变体(VhC3d3)交 联的疫苗读框，即VhC3d3融合蛋白及基因疫苗读框；可增强人类疫苗的体液免疫效应。

背景技术：

研究表明，血清补体成分C3是补体经典途径、旁路途径、MBL途径的交汇与枢纽。 人的C3d(hC3d)基因位于染色体19p13.3-p13.2，由308个氨基酸残基组成，分子量 为35KDa。C3d片段是C3分子被逐级酶解的终末片段，与特异性受体CR2(CD21)结合， 在固有免疫和适应性免疫中起桥梁和纽带作用。首先，C3d-CR2复合物介导、增强B 细胞抗原(Ag)的内化、提呈。CR2胞内结构域酪氨酸残基YY986/987直接或间接参与 蛋白磷酸化作用、信号转导，以促进Ag-CR2内化；并且参与后续Ag-CR2的靶向性， 增强抗原提呈，BCR-CR2交联通过上调B细胞表面CD86分子的表达，增强B细胞作为 APC活化T细胞的功能；其次，C3d-CR2结合促进B细胞活化及分化，Ag-C3d复合物 BCR的Igα/β四聚体与CD21/CD19交联使多种参与Ag识别和信号转导的跨膜分子 [BCR-Igα/β、辅助受体CD21/CD19/CD81(TAPA-1)/Leu13(CD225)、CD45]产生多聚 化，从而诱导Src家族酪氨酸蛋白激酶(PTKs)的Lyn的活化，进一步使Igα/β、CD19 胞内段ITAMs中的酪氨酸(Tyr)磷酸化，随即启动3条信号转导途径，即磷脂酰肌醇 途径、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)途径和磷酸肌醇3激酶(PI3K)，产生不同的第 二信使分别激活不同的转录因子，使B细胞活化、增殖分化。Igα/β与CD21/CD19 交联使细胞内Ca²⁺浓度较单独BCR交联增加；CD19能对低水平激活的信号产生放大作 用，从而降低B细胞活化的阈值，促进更有效的免疫应答。C3d-CD21/CD19复合物能通 过CD21/CD19交联，以抗原非特异性依赖方式活化B细胞；且CR2活化不同于CD19、 BCR途径的特异信号转导机制，主要通过活化PI3K后续通路。此外，C3d-CR2结合促 进记忆性B细胞的产生。生发中心的FDC通过其表面CD21富集C3d/C3dg包被的抗原， 持续向B细胞提供抗原信号；B细胞摄取处理提呈抗原，使Th细胞活化；活化的Th 细胞通过其表面的CD40L及其分泌的多种细胞因子，辅助B细胞的增殖和分化。有赖 于FDC、B细胞、Th细胞三者间的相互作用，生发中心的B细胞经历克隆增殖，抗体可 变区体细胞高频突变，受体编辑，抗体类别转换，亲和力成熟等过程，分化为浆细胞 及长寿记忆性B细胞。

C3d是迄今为止唯一被发现具有选择性增强体液免疫效应的分子佐剂。学者们将不 同靶抗原分子分别与mC3d3基因融合，进行DNA免疫和蛋白免疫，发现C3d分子能增 强DNA疫苗及蛋白疫苗的体液免疫效应，是具有发展潜力的分子佐剂。

以hCGβ避孕疫苗为例，决定其避孕效果的是体液免疫效力，而非细胞免疫。细 胞免疫不仅没有中和hCGβ生物学活性的能力，在一定程度上还存在着导致生殖器靶 细胞自身免疫损伤的危险。因此，用基因工程技术研制hCGβ避孕疫苗，并显著增强 其具有抗生育作用的Th2型及体液免疫效应，削弱Th1型及CTL效应是避孕疫苗的研 究目标。有研究将hCGβ与3个拷贝鼠源性C3d(mC3d3)基因融合，构建真核表达质粒 pcDNA3-hCGβ-mC3d3及phCMV1-hCGβ-mC3d3等。分别制备hCGβ-mC3d3DNA疫苗、蛋 白疫苗、乳酸杆菌疫苗，对不同品系小鼠进行肌肉、皮内、阴道粘膜免疫。结果表明， mC3d3明显增强hCGβ免疫原性；且呈剂量依赖性；显著促进Th2型体液免疫及抗体亚 型转换，并能选择性促进B细胞克隆扩增；促进抗hCGβ抗体亲和力成熟。有研究通 过构建人源性hC3d3的融合质粒-pCI-gs-signal-6His-hCGβ-hC3d3并转染CHO细胞 后获得了目的重组蛋白的正确表达。融合蛋白hCGβ-hC3d3体外研究发现，hC3d3能显 著增强人免疫活性细胞对hCGβ的免疫应答；促进人外周免疫细胞的协同刺激分子表 达。