[发明专利]一种具有降血糖生物活性的苦瓜多肽基因工程制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程，具体涉及一种具有降血糖生物活性苦瓜多肽KGP的基因工程制备方法及其在制备防治糖尿病药物中的应用。

背景技术

糖尿病是现代社会对人类威胁最大的疾病之一，患者呈逐年增加的趋势。目前临床除了静脉注射胰岛素外还主要应用四类口服降血糖药物，它们是磺脲类、双胍类、葡萄糖苷酶抑制剂和噻唑烷酮类。这些口服化学类降糖药物会引起耐药性，乳酸中毒和肝损伤等一系列毒副作用，而采用注射胰岛素疗往往给患者造成很多不便，因此迫切需要一种使用方便、疗效好、副作用小、可长期安全使用的治疗新药。

苦瓜是东南亚国家的一种传统植物药材，经临床实验和动物实验都表明其具有显著的降血糖活性，并且能够缓和和减轻糖尿病引起的并发症。(Kathy Abascal等Alternative & Complementary Therapies，(2005)，179-184)同时在摄入正常剂量的情况下，不会引起任何的肝、肾毒性。(J.K.Grover等Journal ofEthnophamacology，93(2004)123-132)Khanna等在1979年从苦瓜中分离出具有类胰岛素活性的多肽P具有显著的降糖效果。(Pushpa Khanna等Journal of NaturalProducts，44(6)，1979，648-654)其后研究者又从苦瓜中陆续分离出多种物质，包括甙类、蛋白质类等都具有显著的降血糖效果。

由于苦瓜中降血糖活性成分种类多样，作用方式呈多方位多靶点，而其单个活性组分含量较低。因此如何大量提供和生产这些活性组分是作为药品开发需要解决的问题。应用现代生物工程技术将具有降血糖生物活性多肽在生物工程菌中高效表达，实现大规模工业化发酵生产是解决问题的有效途径。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于应用基因工程的方法，克隆目的蛋白基因，在工程菌中高效表达、纯化和功能鉴定具有降血糖生物活性的苦瓜多肽。

本发明提供一种发酵生产具有降血糖生物活性苦瓜多肽KGP的方法。该方法是按照苦瓜中已经公开的降血糖活性多肽的氨基酸序列，根据工程菌偏爱的密码子特性，人工化学合成相应的核苷酸序列，构建表达载体，转化宿主菌，在适当条件下诱导表达，表达的蛋白用亲和层析介质纯化，将纯化的目的蛋白透析去盐，冷冻干燥。

本发明方法包括下列步骤：

(1)PCR法合成两端带有限制性酶切位点的有如SEQ ID：1寡核苷酸序列的具有降血糖生物活性苦瓜多肽KGP核苷酸编码序列，并进一步优化为SEQID：2；

(2)将步骤(1)中得到的核苷酸序列连结到表达载体中，得到重组表达载体；

(3)将步骤(2)中得到的重组表达载体转化到大肠杆菌宿主中，并在表达步骤(1)中所述的核苷酸编码序列的KGP的条件下，培养被转化的宿主细胞；

(4)从步骤(3)培养的宿主细胞的培养基中和细胞内回收并纯化表达产物具有降血糖生物活性的苦瓜多肽。

所述步骤(1)限制性酶切位点N端是BamHI酶切位点，C端是HindIII酶切位点。采用的生物工程菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、面包酵母或毕赤酵母。

步骤(2)表达载体是携带T7/T5启动子的pET/pQE质粒及其衍生物。具体表达载体是pET32a/pQE8。步骤(3)的大肠杆菌宿主是大肠杆菌BL21(DE3)/M15细胞系。步骤(4)的回收并纯化采用镍柱亲和纯化。

本发明的具有降血糖生物活性苦瓜多肽KGP核苷酸编码序列是指从SEQID：2核酸序列的第21个碱基至第75个碱基。其中的KGP核苷酸编码序列是从SEQ ID：2的第23位，第35位的密码子为A；第29位，第38位的密码子为T；第68位和第71位的密码子为A和G中的一种。

根据本发明，首先依据已公开的苦瓜降糖活性多肽序列如SEQ ID：3序列，根据大肠杆菌偏爱的密码子，提供了人工设计合成带有BamHI酶切位点和HindIII酶切位点的核苷酸序列如SEQ ID：1序列。经PCR(聚合酶链式反应)扩增(实施例1)和双酶切反应(实施例2)后连接到pET32a或者pQE8表达载体上，从而得到重组表达载体。将重组表达载体转入大肠杆菌宿主BL21或者M15，于37℃在LB+抗生素的培养基中加入0.4mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达。

根据本发明，重组表达得到的表达产物具有降血糖生物活性的苦瓜多肽N端带有多个(至少5个)连续的组氨酸，最优方案采用镍柱亲和洗脱的方式分离纯化表达产物，步骤少，纯度高，活性损失小。